【研究进展】04092014(7)

我们开始对MTH1是否是S型crizotinib在完整细胞中的作用物进行研究。如何一种细胞蛋白与一种化合物结合，那么与没有结合的对映相比它会通过作用而得到稳定。在使用BJ-KRASV12细胞的一个细胞性热迁移检测中，S型的crizotinib与R型的crizotinib相反，会对验证细胞内不同作用的MTH1具有有效的稳定作用（图2e）。

Figure 2 |(S)-Crizotinib is a nanomolar MTH1 inhibitor.

a,MTH1catalytic assay.Data are shown for both crizotinib enantiomers and the racemic mixture at 100 mM dGTP. Results indicate twotechnical replicates6s.e.m. representative of at leastduplicate experiments (n$2).

b,ITC for MTH1 with (R)- and (S)-crizotinib (n51).

c,(S)-Crizotinibinhibits colony formationof PANC1 and SW480 cells. Images are representative of threeindependent experiments(n53).

d,Comparison of antiproliferative efficacy of (S)-crizotinib versus SCH51344 against SW480cells. Data shown as mean6s.e.m. for three independentexperiments (n53).

e,Cellular thermal shift assayshowing MTH1 target engagement by (S)-crizotinib in intactKRASV12-expressing BJ cells. Images are representative of two independentexperiments (n52).

f, The (S)-crizotinib affinity probe selectivelybinds MTH1, but not ALK,in SW480 lysates, whereas the (R)-enantiomerexerts inverse properties.

图2 S型Crizotinib是MTH1的纳摩尔级别的抑制剂

a，MTH1催化活性检测。数据显示为两种crizotinib的对映异构体以及外消旋体在100uMdGTP条件下。结果表示为两次技术性重复±s.e.m.，代表至少双重重复实验（n≥2）。

b，MTH1与R型和S型crizotinib的ITC结果（n=1）。

c，S型crizotinib抑制PANC1和SW480细胞的克隆形成。图像为三次独立实验的代表（n=3）。

d，比较S型crizotinib与SCH51344对SW480细胞的抗增殖能力。数据表示为均值±s.e.m.，三次独立实验（n=3）。

e，细胞性热迁移检测结果显示在完整KRASV12表达的BJ细胞中MTH1被S型crizotinib作用。图像为两次独立实验的代表（n=2）。

f，在SW480细胞裂解物中，S型crizotinib亲合性探针选择性结合MTH1而不结合ALK，R型对映体显示出相反的性质。

S型crizotinib的特异性和结合模式分析

为了进一步研究crizotinib的这两种对映异构体与细胞蛋白结合的能力，我们制备了它们的衍生物作为适用于药物下拉（pull-down）的化学探针。我们对这些衍生物与ALK和MTH1在SW480细胞抽提物中的作用能力进行了检测。两种对映体都对各自的同源性目标表现出惊人的特异性（图2f）。如果MTH1在其他RAS转化的细胞中确实是S型crizotinib的关键作用目标的话，那么它在像以前用SCH51355做过的那种无偏好化学蛋白质组学实验中应该出现在特异性相互作用名单的首位。目前为止MTH1是S型xrizotinib的最特异最突出的相互作用因素（扩展数据图2e）。绘制SCH51344和S型crizotinib彼此相互验证的化学蛋白质组结果会发现MTH1是二者唯一共同的高显著性作用因素（图3a）。我们还进行了使用R型crizotinib的互补性分析，R型crizotinib已经确认出许多激酶，这些激酶都可以被游离的药物竞争，但MTH1没有这种作用（扩展数据图2f）。值得注意的是，将二者的特征进行比较并没有发现任何蛋白可以显著性地与两种对映异构体都结合（图3b）。为了排除两种crizotinib的对映异构体可能与丰度很低的激酶作用的可能，我们对由456种不同重组激酶的数据库进行了查验（KINOMEscan，扩展数据图3）。与化学蛋白质组结果相一致，两种对映异构体显示出非常不同的高度立体选择性。很少的几个S型crizotinib显示一定亲合性的激酶并没有计算为显著性抑制。R型crizotinib不仅结合10倍数量以上的激酶，而且还被预测可以有效抑制其中至少十种激酶，包括熟知的内源性作用目标ALK和MET，还包括LCK、IRAK1、JAK3、LOK（亦称为STK10）和SLK。为了理解二者在与MTH1结合中的差异，我们将R型和S型的crizotinib与重组蛋白进行了共结晶。形成的结构显示在手性中心的甲基基团具有一种不良的重叠构象，而在苯甲基环上的一个氯取代基似乎会降低R型crizotinib结合作用的能量支持（图3c，d，扩展数据图4，5）。ITC数据证实R型和S型crizotinib结合之间的差异完全是熵值性的而不是由于与蛋白的不同结合作用造成的（图2b）。

Figure 3 |Specificity and MTH1 co-crystal structure of (S )-crizotinib.

a,b,Comparison of (S)-crizotinibspecificity versus SCH51344 (a)and (R)-crizotinib (b). MTH1 is the only sharedtarget with SCH51344 and isspecific to (S)-crizotinibwhen compared to (R)-crizotinib.Data represent two independentexperiments for each condition (n=2 per condition), and each replicate was analysed in twotechnical replicates.

c,Co-crystal structure of(S)-crizotiniband MTH1. MTH1 is in pink with light green alpha-helices and the loops covering thebinding site in blue. Hydrogen-bonding interactions are shown by dashed red lines.

d, MTH1 interactions with (R)- and (S)-crizotinib. Left panel shows (R)-crizotinib in yellow; thethinner lines indicate part ofthe (R)-crizotinibthat was not resolved in the electron density. Right panel shows (S)-crizotinib in cyan;alternate protein conformations in the absence of (S)-crizotinib are shown in dark green.

图3 S型crizotinib的特异性以及与MTH1共结晶的结构

a，b，比较S型crizotinib与SCH51355（a）和R型crizotinib（b）的特异性。MTH1是SCH51344的唯一作用目标，而与R型crizotinib相比，对S型crizotinib具有特异性。数据代表每个条件下两次独立实验（每个条件n=2），每个重复为两次技术性重复。

c，S型crizotinib与MTH1的共结晶结构。MTH1为粉色，带有浅绿色α螺旋，覆盖在结合位点上的环式结构为蓝色。虚线表示氢键相互作用。

d，MTH1与R型或S型crizotinib的相互作用。左图R型crizotinib为黄色；细线表示部分R型crizotinib在电子密度中没有解析出来；右图S型crizotinib为天蓝色，没有S型crizotinib时另一种蛋白构象图中显示为深绿色。

MTH1的抑制剂会在癌细胞中诱发DNA损伤

由于一般认为MTH1会阻止氧化性核苷酸向DNA中进行整合，因此我们推测新的MTH1抑制剂应该增加基因组中8-oxo-鸟苷的含量，这样会诱发DNA损伤。使用MTH1抑制剂处理的SW480细胞中，53BP1（亦称TP53BP1）和自磷酸化的ATM免疫荧光染色结果发生了增加，二者是DNA损伤的特异性标记物（图4a，扩展数据图6a）。当我们使用MTH1的siRNA对细胞进行转染时可观察到的53BP1集落的形成，这种集落在更高水平8-oxo-鸟苷的细胞核中由于基因组整合作用的增加而发生富集（扩展数据图6b，c）。我们还试图通过高质量液相色谱质谱联机的方式对氧化性核苷酸进行定量，但由于高实验背景而没有获得可靠的结果。因为8-oxo-鸟苷的积累应该激活碱基切除修复作用（BER）并诱发DNA单链断裂，因此我们在碱性彗星检测（单细胞凝胶电泳）中对抑制剂进行了测试。S型crizotinib和SCH51344都会形成显著的彗尾现象，而R型crizotinib则没有，这与细胞经MTH1的siRNA转染结果很相似（图4b）。除了纯化的8-oxo-鸟苷或2-OH-腺苷特异性的DNA糖基化酶之外，OGG1和MUTYH都会显著增加S型crizotinib的彗尾现象，这一现象为抑制剂处理使损伤强烈积累提供了证据（扩展数据图6d）。

MTH1的过量表达显著性地减少了由S型crizotinib以及SCH51344诱发的DNA单链断裂的数量，但对H2O2则没有这种效应（图4c，扩展数据图6e），这为MTH1作为功能相关性作用目标提供了证据。为了研究对于MTH1抑制时p53在细胞中的应答情况，我们制备了一种SW480Tet-on系统，这一系统可以使细胞中产生诱导性的p53shRNA的表达，然后我们对细胞进行抑制剂处理（扩展数据图7），结果说明抑制剂是一种不依赖于p53的作用模式。对表达抗MTH1shRNA的SW480细胞分别使用ATM和ATR抑制剂KU55933和VE821处理也没有显示出任何的差异性效应（扩展数据图8）。同样，Atm-/-的小鼠成纤维细胞也与其Atm完整的对照对于MTH1抑制剂显示同等的敏感。使用带有其他在DNA修复方面基因突变的细胞株进行研究，我们发现缺失p21的HCT116细胞对S型crizotinib表现出特殊的敏感性。我们在BJ皮肤成纤维细胞中对抑制剂进行检测，这些成纤维细胞包括野生型、经hTERT转化的永生型以及通过SV40T或突变的KRAS进行转化后的细胞。SCH51344和S型crizotinib都显示出对SV40T以及KRASV12细胞的最高毒性（扩展数据图9）。

重要的是，当我们使用R型或S型crizotinib来处理野生型BJ细胞时，我们发现S型对映异构体对于未转化细胞并不显示出任何增加的毒性。在一组人的癌细胞株中，我们持续发现S型crizotinib具有强抗增殖的效应，这与其较低的催化性检测IC50值是一致的。为了研究体内水平S型crizotinib对肿瘤生长的破坏作用核苷酸合成抑制剂，我们使用SW480细胞进行小鼠的移植实验。这些实验结果说明S型的crizotinib而不是R型的crizotinib可以破坏肿瘤的整体发育以及特异性地减少肿瘤的体积达50%以上（图4d，e，扩展数据图10a-c）。这说明两种镜像异构体具有明显不同的抗肿瘤特征，这与它们不同的分子作用机制是一致的。