【研究进展】04092014(6)

Our results propose (S)-crizotinib as anattractive chemical entity for further pre-clinical evaluation, andsmall-molecule inhibitors of MTH1 in general as a promising novel class ofanticancer agents。

摘要 激活的RAS GTPase 信号传导作用是癌症形成性质转化作用以及恶性疾病形成的一个重要驱动因素。依赖于RAS的癌症细胞模型已经被用于确认出实验性小分子，如SCH51344，但这些小分子作用的分子机制普遍还是未知的。在此我们使用一种化学蛋白质组学的方法，确认出SCH51344的作用目标是人的mutT同源物MTH1（亦称为NUDT1），它是一种清理核苷酸汇集物的酶。丧失MTH1的功能会导致KRAS肿瘤细胞生长受到损伤，而过量表达MTH1则会减轻癌细胞对SCH51344的敏感性。通过对更多类似药物的抑制剂的搜索，我们确认出激酶抑制剂crizotinib是一种纳摩尔级的MTH1活性抑制剂。让我们感到意外的是，临床上所使用的R型药物的对映异构体（enantiomer）是非活性的，而其S型对映异构体则会选择性地抑制MTH1的催化活性。酶促检测、化学性蛋白质组特征分析、激酶基因组范围活性检测以及与两种对映异构体的共结晶结构结果为我们对这一让人惊讶的立体特异性提供了一个合理的解释。通过S型crizotinib进行的MTH1的抑制使核苷酸汇集物的稳定状态被破坏的结果会诱导DNA单链断裂的增加，在人的结肠癌细胞中增加激活的DNA修复作用，并会有效抑制动物模型中的肿瘤生长。我们的结果说明S型crizotinib是一种值得进一步进行预临床检测的引人注目的化合物，这是一种广泛意义上抗癌药物中的一种充满希望的新类型小分子MTH1的抑制剂。

（正文）

人类癌症中普遍存在RAS异构体的突变，而这种突变往往伴随癌症的预后不良和存活率低的特点，这种现象亟需我们研制出新的治疗方法。在药物开发中直接对RAS的活性进行调节非常困难。因此人们用其他方法取代，比如通过对RAS翻译后修饰作用的干扰来阻止活性蛋白的成熟以及蛋白到质膜上的定位。此外，人们还用表型筛选来寻找对RAS转化的癌细胞具有选择性作用的小分子。1995年，这项筛选工作发现了一种被命名为SCH51344的化合物，这种化合物可以对RAS转化的成纤维细胞不依赖于锚定作用的细胞生长进行抑制。由于SCH51344并不影响MAPK信号传导作用，而一般认为MAPK的信号传导作用是RAS成癌活性的主要调节剂，因此我们认为SCH51344具有一种新的但未知的作用模式。

确定MTH1是SCH51344的主要作用目标

我们使用一种化学蛋白质组学方法来确定SCH51344的细胞性作用目标（图1a）。我们将KRAS阳性的SW480细胞裂解物与我们制备的SCh51344亲合性探针共同孵育（图1b），已知KRAS阳性的SW480细胞对SCH51344具有敏感性，然后我们通过质谱来对结合蛋白进行分析。我们通过使用游离的未修饰化合物的竞争作用将高亲合性结合蛋白与大量低亲合性结合蛋白区分开。生物信息性分析结果显示人的7,8-二羟基-8-氧桥鸟嘌呤三磷酸酶MTH1（亦称NUDT1）和腺苷激酶（ADK）是SCH51344的主要细胞性作用目标（图1c）。有报道指出MTH1通过阻止活性氧诱发的DNA损伤来协助RAS转化的细胞克服致癌基因诱导的早衰现象。相反我们对ADK在恶性疾病中的作用知之甚微，但与已经发表的RNA干扰数据相一致的是，我们使用ADK抑制剂ABT-702对SCH51344敏感性的PANC1人胰腺癌细胞进行处理后并没有发现对细胞的生长产生任何阻碍作用。因此我们致力于MTH1是SCH51344最相关的作用目标。经免疫印迹证实在SW480细胞和DLD1细胞中SCH51344与MTH1的结合作用后（扩展数据图1a），我们使用等温滴定热量测定（ITC）确定出SCh51344的Kd值为49nM（图1d，扩展数据图1b）。

MTH1是细菌性mutT的同源物，mutT是一种对核苷汇集物具有清理作用的酶，它可以对诸如8-氧桥脱氧鸟苷三磷酸（8-oxo-dGTP）进行切割，从而将三磷酸转化为相应的单磷酸。这种水解反应保证了氧化性核苷酸不再被DNA聚合酶所识别，从而阻止了DNA复制过程中由于碱基错配而产生颠换突变的可能。为了研究SCH51344对MTH1催化活性的影响，我们对核苷三磷酸水解产物焦磷酸（PPi）的生成进行了监测。我们确定出SCH51344对于MTH1作用底物dGTP、8-oxo-dGTP和2-OH-dATP的半最大抑制浓度（IC50）的值分别为215nM、410nM和675nM，这样证实了SCH51344对MTH1的催化活性具有直接的影响（图1e）。为了对SCH51344的抗细胞增殖效应是作用于MTH1的结果进行验证，我们使用NUDT1（MTH1）短干扰RNA对人的SW480和DLD1细胞进行转染，结果对克隆形成具有破坏作用（图1f）。使用慢病毒短发夹RNAs进行的稳定性降低表达会产生与使用抑制剂相同的表型（扩展数据图1c）。相反，过量表达MTH1会降低SW480细胞对SCH51344的敏感性（图1g，扩展数据图1d），从机制方面协同性地提供了MTH1是SCH51344细胞性作用目标的证据。

Figure 1 | MTH1 isthe target of SCH51344.

a,Representation of the chemicalproteomic workflow.

b,Structures of SCH51344 (1)and the probe usedfor affinity purification (2).

c,Results from mass-spectrometry-based proteomic affinity purification experimentusing SAINT and competitionanalysis. Data shown are based on two independent experimentsfor each condition(n=2 per condition), and eachreplicate was analysed in twotechnical replicates.

d,ITC data for MTH1 with SCH51344. The measured Kd was 49nM (n=1).

e,SCH51344 inhibits hydrolysis of the MTH1 substrates dGTP, 8-oxo-dGTP and2-OH-dATP, respectively. Data are shown for two technical replicates6s.e.m. and are representativeof at least duplicate experiments(n≥2).

f,Silencing ofMTH1 by siRNAimpairscolony formation ofKRAS-positive SW480 (top) and DLD1 (bottom) cells. Data shown as mean±s.e.m. and images arerepresentative of triplicate experiments (n=3) (P<0.05, t-test). Asterisk denotes unspecific band.

g, MTH1 overexpression as monitored by real-time PCR(left) restores SW480 cell viability upon SCH51344 treatment (right). Data shown asmean±s.e.m.and images are representativeof three independent experiments (n=3).WT, wild type.

图1 MTH1是SCH51344的作用目标

a，化学蛋白质组学方法工作流程示意图。

b，SCH51344的结构（1）和用于亲合纯化的探针（2）。

c，使用SAINT和竞争作用并基于蛋白质组学性亲合纯化后质谱的结果。数据基于美国条件下两次独立实验，每次重复为双重技术性重复。

d，MTH1与SCH51344的ITC数据。测得的Kd值为49nM（n=1）。

e，SCH41344对MTH1水解作用底物dGTP、8-oxo-dGTP和2-OH-dATP的分别抑制作用。数据显示为两次技术性重复±s.e.m.核苷酸合成抑制剂，代表至少双重重复的实验结果（n≥2）。

f，通过siRNA对MTH1的沉默作用会破坏KRAS阳性的SW480细胞（上）和DLD1细胞（下）的克隆形成作用。数据显示为均值±s.e.m.，图像代表三重重复实验（n=3）（P<0.05，t-检验）。星号表示非特异性带。

g，通过实时PCR监测的MTH1过量表达会恢复SW480细胞由于SCH51344处理而降低的细胞存活率。数据显示为均值±s.e.m.，图像为三次独立实验（n=3）。WT，野生型。

S型crizotinib对映异构体对MTH1活性具有抑制作用

由于SCH51344并没有在临床条件下得到检验，因此我们决定筛选其他具有更好药理（pharmacokinetic）和药效（pharmacodynamic）而且可以更有效抑制MTH1的抑制剂。基于底物和活性位点的结构我们认为激酶抑制剂可能会对MTH1起作用。通过热迁移稳定性检测方法对一个激酶抑制剂库进行筛选，我们发现对c-MET和ALK具有双重抑制作用的crizotinib显示出对MTH1的高度亲合性。Crizotinib不久前被批准用于EML4-ALK阳性非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗并且应用在其他几项临床检测中。然而使用催化性MTH1的检测方法，我们发现从不同供应商获得的不同批次crizotinib会产生出不一致的IC50值。这一现象不能用产品不纯或降解来解释，因为分析性数据与文献是一致的。因为crizotinib具有一个手性中心，因此我们考虑不同批次的抑制剂中crizotinib立体异构体的量可能有所不同。我们在MTH1催化检测中制备并检测了纯的、临床应用的R型以及迄今未有人研究的S型crizotinib的对映异构体，说明筛选过程中遇到含外消选体混合物的批次产品。我们发现纯S型crizotinib显示为低纳摩尔级MTH1的抑制剂而R型对映体却给出微摩尔级的IC50值（图2a）。

这些数据都经过直接结合检测（ITC）证实过，说明S型对映体对于MTH1的亲合性要比R型高16倍（图2b，扩展数据图2a）。使用Km浓度底物，我们确定出S型crizotinib与MTH1底物8-oxo-dGTP和2-OH-dATP的IC50值分别为330nM和408nM（n=2）。与这些数据相一致的是，S型crizotinib会有效抑制SW480细胞和KRAS突变的PANC1细胞的克隆形成，这与SCH51344很相似（图2c，d）。体外Kd测量结果说明S型crizotinib对已知作用物ALK、MET和ROS1的效率要比R型略低（扩展数据图2b）。使用特异性c-MET抑制剂对SW480细胞进行处理并不能对细胞增殖产生检测得到的显著性效应，这种特异性c-MET抑制剂可能会是S型crizotinib的脱靶效应作用物（扩展数据图2c）。然而对MTH1过量表达是否会将SW480细胞从S型crizotinib诱导产生的类似于SCH51344的使细胞死亡的效应中挽救过来，我们研究的结果是并没有见到任何IC50数值的显著性变化（扩展数据图2d），这一现象产生的问题是是否还有其他的作用物对细胞致死的效应起作用。