【研究进展】04092014(3)

b，在U2OS和VH10细胞暂时性转染MTH1siRNA或无目标siRNA6天后8-oxodGTP在DNA中的整合（Avidin-AlexaFluor488活性物质）以及53BP1集落形成的诱导作用。过量表达野生型MTH1（WT）而不是没有催化活性的突变（E56A）会挽救8-oxodG的整合以及53BP1集落形成。

c，在U2OS细胞经siRNA转染6天后在带有过量表达野生型和无催化活性的突变型（E56A）MTH1的细胞中53BP1集落形成的定量检测结果。数据显示为均值±s.d.，来自三次独立实验（每个样本中细胞数大于200个）。**P<0.01，单向方差分析。

d，经siRNA作用使MTH1被删除会在DNA中增加8-oxodG和2-OH-dA的水平。经MTH1的siRNA 1号或无目标siRNA转染的U2OS细胞与OGG1、MUTYH或缓冲液（对照）单独在37°C条件下共同孵育45分钟后的单细胞凝胶电泳结果。

e，对单细胞凝胶电泳的彗尾现象定量分析结果。数值代表均值±s.e.m.，来自两次独立实验（每次实验使用超过100个细胞）。

由MTH1缺失诱导的DNA损伤可以激活RAD51和DNA-PKcs介导的DSB修复作用，还可以产生ATM依赖性的p53磷酸化以及p53目标基因p21的表达上调（图2a，扩展数据图2k，l）。已知p53会在DNA损伤后介导细胞凋亡的发生，而在U2OS细胞中通过短发夹RNA（shRNA）介导将p53删除则会在siRNA介导的MTH1删除后阻止p21的诱导生成以及细胞凋亡的发生（图2g-i）。然而DNA损伤也可以在p53删除的细胞中诱导产生，而p53的状态则对组蛋白H3上9号赖氨酸（H3K9me3）的三重甲基化作用没有影响，H3K9me3是早衰的一个标记物（图2h）。我们接着制备了稳定携带强力霉素（doxycycline）诱导针对MTH1的shRNA载体而具有TP53突变的SW480直肠结肠癌细胞，这种细胞株在进行诱导时会减少MTH1的表达以及克隆性细胞的存活率（图2j，k）。在小鼠体内，带有MTH1shRNA构建物的肿瘤在将强力霉素加入到饮用水中后都产生了疗效，使小鼠的存活率得到了提高（图2l，m，扩展数据图2m，n）。带有表达非目标性shRNA肿瘤的小鼠在强力霉素处理后对肿瘤的生长没有影响。

Figure 2 | MTH1activity is required to prevent DNA damage and promote tumour growth inxenograft mice.

a–d, After MTH1 siRNAtreatment, ATM autophosphorylation at serine1981 (a),RAD51foci (b),phosphorylated DNAPKcs pS2056 foci (c) and caspase 3 cleavage(apoptosis) (d)were visualized. Expressionof siRNA-resistant MTH1 wild-type prevents ATM activation, RAD51 foci, DNA-PKcs pS2056foci and apoptosis but not expression of MTH1 catalytically dead mutant (E56A).Nuclei are indicated with thin blue lines. Scale bar, 10 um.

e,Quantification of RAD51 foci. Data shown as average±s.e.m. from three independent experiments (≥200 cellsper sample). *P<0.05, ** P<0.01,one-wayANOVA.

f,Quantification of cleaved-caspase-3-positive cells from panel d. Data shown as average±s.e.m. from two independent experiments (P<0.05, one-way ANOVA).

g,h,Western blot (g) and immunofluorescence (h) of U2OS cells depleted ofp53 by doxycycline inducible shRNA expression (p53 shRNA)and transfected with non-targeting siRNA (NT) or MTH1 siRNA(M). h,Images of cells immunostained forapoptosis (cleaved caspase 3) and senescence (H3K9me3). Nucleiare indicated withthin blue lines.

i,Quantification of cleaved caspase 3 cells from panel h. Data shown as average±s.d. fromtwo independent experiments.

j,Western blotof protein lysates isolated from SW480 cells with either non-targeting shRNA or MTH1 shRNAafter 72-h treatments with 2 mgml21 doxycycline (dox) in the medium.

k,Clonogenic survival of SW480 cells of the cells in panel j. Cells were treated with doxycycline for72 h and re-seeded for colonyoutgrowth. Values are indicated as survival compared tonon-doxycycline treated control cells and representaverage±s.d.from three independent experiments.

l, m, SW480 cells expressingdoxycycline-inducible MTH1shRNA or non-targeting shRNA were injected into SCID mice(subcutaneous) (n55 per group). After 7 days, doxycycline wasadded (arrow) to the drinkingwater. l,m,Tumour volume decreased (l)and survivalincreased in xenograft mice(m)with MTH1 shRNAdepletion.

图2在肿瘤移植小鼠体内MTH1的活性是阻止DNA损伤并促进肿瘤生长所必需的。

a-d，经MTH1的siRNA处理后，可以见到ATM在1981位置丝氨酸的自磷酸化（a），RAD51的集落形成（b），磷酸化的DNA-PKcspS2056的集落形成（c）以及caspase的切割（细胞凋亡）（d）。表达对siRNA具有抗性的MTH1野生型会阻止ATM的激活作用、RAD51的集落形成、DNA-PKcspS2056的集落形成以及细胞凋亡，但表达没有催化活性的MTH1则没有这些效应。细胞核使用细蓝线标示。比例尺为10um。

e，对RAD51集落形成的定量结果。数据显示为均值±s.e.m.，来自三次独立实验（每个样本中细胞数大于200个）。*P<0.05，**P<0.01，单向方差分析。

f，d组图中被切割caspase3阳性细胞的定量结果。数据显示为均值±s.e.m.，来自两次独立实验（P<0.05，单向方差分析）。

g，h，U2OS细胞通过强力霉素诱导shRNA（p53shRNA）删除p53并转染无目标siRNA（NT）或MTH1的siRNA（M）后的免疫印迹（g）和免疫荧光（h）结果。h组图中细胞进行对调亡（切割后的caspase3）和早衰（H3K9me3）的免疫染色成像。细胞核用蓝色细线标示。

i，对组图h切割后caspase3的定量结果。数据显示为均值±s.d.，来自两次独立实验。

j，使用无目标shRNA或MTH1shRNA经72小时2ug/ml强力霉素处理后的SW480细胞蛋白裂解物的免疫印迹

k，组图j中SW480细胞的存活率。细胞经强力霉素处理72小时后重新种植进行克隆生长。数值代表与无强力霉素处理的对照细胞比较，均值±s.d.，来自三次独立实验。

l，m，表达强力霉素诱导MTH1shRNA或无目标shRNA的SW480细胞注射到SCID小鼠（皮下）中（每组5只小鼠）。7天后将强力霉素加入到小鼠的饮用水中。经MTH1的shRNA删除作用后的小鼠肿瘤体积减小，生存增加。

MTH1抑制剂的研制

我们的数据证实MTH1的催化活性是癌细胞存活所必需的，因为只有RNAi抗性的野生型MTH1而不是失去催化活性的MTH1（E56A）突变可以恢复存活。这说明可以通过对MTH1的抑制来获得相似的效应。我们纯化了MTH1蛋白，在化合物库中进行了筛选并确认出含有2-氨基嘧啶基序的小分子可以有效抑制MTH1的催化活性。引入一个氨甲基取代的TH086（1）化合物得到了对MTH1抑制效率的极大提高（扩展数据图3b-e）。将初步筛选扩大后，我们确认出TH287（2）是一种有效的MTH1抑制剂（半最大抑制浓度IC50为0.8±0.1nM；扩展数据图3）。

在体外和体内水平TH287都可以通过对氨甲基取代基团的N-脱烷基化作用在人或小鼠的肝脏微粒体（microsome）中被快速代谢（扩展表2，扩展数据图4a）。在TH588（3）中将甲基替换为环丙基会提高在体外和体内水平的代谢稳定性并同时保持对MTH1的抑制效率（IC50=5.0±0.2nM）（扩展数据图3，4b，c，扩展数据表2）。相反，在TH650（4）中引入一个氧杂环丁基也可以提高代谢的稳定性但却大幅度降低了对MTH1的抑制效率（IC50=2.1±0.1uM）。使用一种目标作用检测方法，我们观察到MTH1抑制剂TH287和TH588可以在细胞中与MTH1蛋白结果，但TH650则不能。

MTH1抑制剂的共结晶

为了进一步获得TH287和TH588是如何抑制MTH1的机制性认识，我们在分辨率为1.6?的条件下对MTH1与TH287或TH588的复合物晶体的结构进行了解析（图3，扩展数据表1，扩展数据图3i，j）。在TH287和TH588中的氨基嘧啶与MTH1活性位点上Asn33、Asn119和Asp120之间形成关键性氢键结合（图3b-d）。结果在TH588中原来的二氯苯环的取代基环丙基在TH287和TH588之间旋转了180°。在TH287中的氨甲基和TH588中对应的氨基似乎对于化合物的亲合性和特异性非常重要，我们认为在NH和Asp119之间的氢键可能会模拟8-oxodGTP的6-enol的状态，6-enol之前被认为对特异性有重要作用。

Figure 3 |Structural details of TH287 binding to MTH1.

a,Overall structure ofMTH1 shown in cartoon representation and coloured blue to red from amino to carboxy terminus.The bound TH287 inhibitor is shown in sticks representation.