【研究进展】04092014(4)

b,Sliced surface representation, highlighting the deep pocket of MTH1 (cyan) where TH287 (darkteal) is bound. The three residues that form hydrogen bonds to TH287 are marked in thefigure.

c,Close-up view of the bindingsite, comparing the TH287 (dark teal) ligand with the TH588 (orange) ligand, with the hydrogenbonding distance marked out inA? .

d, Comparison of TH287 (dark teal) and8-oxodGMP (violet) binding to MTH1, with important residues in the binding sitemarked.

图3 TH287与MTH1结合的结构细节

a，MTH1图示结构草图，蓝色为氨基端，红色为羧基端。结合的TH287抑制剂显示为棒状。

b，结构剖面展示，强调TH287（深蓝绿色）结合位置的MTH1（天蓝色）处深口袋式结构。图中与TH287形成氢键的三个残基被标注。

c，结合位点的放大视图，比较TH287（深蓝绿色）配体与TH588（橘黄色）配体，氢键结合距离以?为单位在图中标示出。

d，TH287（深蓝绿色）和8-oxodGMP（紫色）与MTH1结合的比较，结合位点处重要残基在图中标示出。

MTH1的抑制剂导致癌细胞死亡

我们观察到MTH1的抑制剂TH287和TH588会选择性地而且有效地杀死U2OS以及其他癌症细胞株，但对于几种原代或永生化细胞的毒性相对要小一些（图4c，扩展数据图5j-m）。这一现象与MTH1是癌细胞存活所必需的而在非转化细胞中则不是必需的相一致。具有结构相似性的化合物TH650在细胞中并不与MTH1蛋白结合，也对MTH1没有抑制作用，在任何用于检测的细胞株中都不产生毒性，说明TH287和TH588诱导产生细胞毒性的机制是抑制MTH1（扩展数据图5n）。需要注意的是，虽然MTH1的抑制剂是低纳摩尔浓度酶促性抑制剂，但这些抑制剂只在低微摩尔浓度时才具有细胞毒性。这并不是一个很特殊的现象，可以通过药物动力学或药理学特征如癌细胞中高蛋白结合作用或低渗/外向流量来解释（扩展数据表2）。

我们预计通过对MTH1抑制而表现出其毒性的化合物将会增加8-oxodG到DNA中的整合。事实确实如此，我们发现在U2OS细胞经TH287和TH588处理后其DNA中的8-oxodG有所增加，但在VH10细胞中经这两种化合物处理，或者U2OS细胞经TH650处理都没有这种效应（图4d-g，扩展数据图5a，c），这与我们设想的作用机制相符合。还有，MTH1抑制剂TH287和TH588二者都可以诱导产生DNA损伤（53BP1，RPA和磷酸化DNA-PKcs集落形成）以及激发ATM-p53介导的细胞死亡回应并在U2OS细胞中的DNA修复作用，但在VH10细胞中没有这些现象（图4h，扩展数据图6）。然而p53的状态并不影响使用TH287或TH588处理后细胞的存活率（扩展数据图5f-i），这种现象的解释就是DNA损伤是在不依赖于p53状态的条件下引入的。总的来看，MTH1的抑制剂可以诱发类似于MTH1的siRNA删除后所见到的DNA损伤应答和细胞死亡机制。虽然OGG1和MUTYH蛋白在DNA中对于修复8-oxodG和2-OH-dA的损伤是重要的，但不同的表达水平或OGG1抑或MUTYH的过量表达并不影响MTH1抑制剂产生的细胞毒性效应（扩展数据图7，8），这可能是DNA中氧化性碱基过多，使碱基剪切修复系统崩溃，或者8-oxodGTP或2-OH-dATP产生出导致细胞死亡的信号。还有，OGG1、MUTYH活MTH2的表达水平在MTH1被删除后没有发生改变（扩展数据图8b-d）。

为了确定癌症转化进程中在哪一个点上细胞变得对MTH1抑制剂开始敏感的，我们使用了一种遗传体系，在这一体系中原代BJ细胞以分步转染的方式进行转化，转染的内容有hTERT、SV40 大T抗原以及Ras。TH287和TH588对于SV40-大T-抗原和Ras表达的BJ细胞具有选择性细胞毒性（图4i，扩展数据图5o，q），证实MTH1在转化进程的早期变得重要，这时候MTH1的表达量也开始增加（扩展数据图7）。

Figure 4 |Inhibition of MTH1 induces oxidative DNA damage and reduces survival in cancercells.

a,Chemical structure of the MTH1 inhibitors TH287 and TH588 and the poor inhibitor TH650. IC50values shown as average ofthree independent experiments.

b,Target engagement of MTH1 inhibitor to MTH1 protein in intact cells. The MTH1protein precipitates in cells above 54 °C. Potent MTH1 inhibitors stabilize theMTH1 protein >54°C.

c,Clonogenic survival of primary/immortalized (open) or cancer cells (filled) after TH588 treatment. Valuesrepresent percentage of colonies in relation to DMSO-treated controls displayed as average±s.d. from three independent experiments. d–f, U2OS cells (d, e) or VH10 cells (f) were treated with 10 uM MTH1 inhibitor for 24 hbefore being incubated with OGG1, to selectively cut out 8-oxodG from DNA, and runin alkaline Comet assay. H2O2 was used as control. Tail moment,calculated as % DNA in the tail multiplied by the tail length. Values representaverage±s.e.m.from three experiments; **P<0.01, ***P<0.001, one-way ANOVA.

g,Quantification of 8-oxodGTPincorporation inDNA (avidin-AlexaFluor488reactive substance) in U2OS andVH10 cells treated with MTH1 inhibitors (20 uM). Bars show average6s.e.m. of three independentexperiments. Asterisks mark a significant difference (*P<0.05,**P<0.01,one-sided Student’s t-test).

h,U2OS cells were seeded in96-well plates and treated with MTH1 inhibitors for 72 h and 53BP1 foci formation determined. Values representpercentage of cells with>953BP1 foci percell, average±s.e.m.from three experiments.

i, Viability of BJ cells with hTERT, hTERT/SV40T (‘SV40T’)or hTERT/SV40T/RasV12 (‘RasV12’) after 72 h TH588 treatment. Data shown as average±s.e.m. from two independent experiments.

图4 MTH1的抑制会诱导产生氧化性DNA损伤并降低癌细胞的存活率

a，MTH1抑制剂TH287和TH588以及较差的抑制剂TH650的化学结构。IC50值以三次独立实验的均值显示。

b，在完整细胞内MTH1抑制剂对MTH1蛋白的目标作用。细胞温度为54°以上时MTH1蛋白会发生沉淀。而有效的MTH1抑制剂会在温度高于54°时对MTH1蛋白具有稳定作用。

c，原代或转化后的细胞（空心）或癌细胞（实心）在TH588处理后的克隆性存活率。数值代表相对以DMSO处理为对照的百分比，显示为均值±s.d.，来自三次独立实验。

d-f，U2OS细胞（d，e）或VH10细胞（f）经10uMMTH1抑制剂处理24小时，然后与OGG1进行共同孵育。OGG1可以选择性地从DNA中切除8-oxodG，然后进行碱性彗星检测（单细胞凝胶电泳）。实验中使用H2O2作为对照。彗尾现象按彗尾中DNA百分比乘以彗尾的长度来计算。数值代表均值±s.e.m.，来自三次实验；**P<0.01，***P<0.001，单向方差分析。

g，U2OS和VH10细胞使用MTH1抑制剂（20uM）处理后对整合在DNA中的8-oxodGTP的定量分析。数值柱显示均值±s.e.m.，来自三次独立实验。星号表示显著性差异（*P<0.05，**P<0.01，单侧Studentt-检验）。

h，U2OS细胞种植在96孔板上并使用MTH1抑制剂处理72小时后对53BP1集落形成进行测定。数值代表每个细胞形成9个以上53BP1集落的细胞百分比，均值±s.e.m.，来自三次实验。

i，经TH588的72小时处理后表达hTERT、hTERT/SV40T或hTERT/SV40T/RasV12的BJ细胞存活率。数据显示均值±s.e.m.，来自两次独立实验。

MutT可以挽救MTH1抑制剂的细胞毒性

我们知道许多小分子的性质是缺乏规律的，比如有几个激酶的抑制剂可以和许多激酶作用目标结合。由于TH287和TH588是nudix水解酶蛋白家族的首创性抑制剂，因此我们想确定这些化合物对于nudix蛋白家族的其他成员的选择性如何。因此我们将MTH2、NUDT5、NUDT12、NUDT14、NUDT16和其他具有已知核苷三磷酸焦磷酸活性即dCTPase、dUTPase和dITP的蛋白进行了表达、纯化并且研制了这些蛋白酶促活性的检测方法。TH287和TH588对于MTH1具有高度选择性，在100uM浓度时对于其他检测的蛋白没有相关的抑制作用（图5a，扩展数据图8h，i）。虽然在更大的87种酶、GPCRs、激酶、离子通道及运输蛋白组成的检测群中TH588显示出一定的选择性（扩展数据图8g），但这种化合物还可能有其他我们还不知道的非目标性活性。为了说明这种可能性，我们纯化了大肠杆菌的MutT蛋白，MutT是MTH1的细菌性同源物，具有8-oxodGTPase活性。我们证实了MutT既没有被TH287也没有被TH588所抑制（图5b）。需要注意的是，在线粒体或细胞核中表达的MutT酶可以部分挽救由于TH287和TH588所产生的细胞毒性和53BP1的诱导产生（图5c，d），这证实了在人细胞中8-xoxdGTPase的恢复减少了化合物所产生的毒性。MutT为什么没有完全反转化合物毒性的原因可能是由于其缺乏2-OH-dATPase活性，因为2-OH-dATPase也对产生毒性起作用。