【研究进展】04092014(5)

MTH1抑制剂的体内水平活性

我们的数据说明MTH1的抑制作用可能会成为治疗癌症的一种有效方式。恶性黑色素瘤具有异质性、体细胞性突变多以及通常对治疗具有抗性的特征。从一位携带BRAFV600E突变黑色素瘤衍生的转移癌细胞对于卡铂（carboplatin）、氮烯咪胺（dacarbazine）和威罗菲尼（vemurafenib）具有抗性，这种癌细胞经串行性两次在小鼠体内移植。10只携带这种肿瘤的小鼠被随机进行每天接受TH588或对照物一次处理。所有TH588处理后的小鼠肿瘤的生长速率都下降了，虽然药物动力学研究显示TH588在血清中的水平处理24小时后会降低到IC50之下（图5e，f）。此外，SW480直肠结肠癌和MCF7乳腺癌肿瘤的移植实验也对每天一次TH588的处理产生了疗效（扩展数据图4），这说明以MTH1为作用目标可能是各种不同肿瘤的一种有效治疗方法。

Figure 5 | TH588reduces tumour growth via MTH1 inhibition.

a,In vitro activityof human MTH1, MTH2 (NUDT15), NUDT5, NUDT12, NUDT14, NUDT16, dUTPase, dCTPase andITPA treated with varying concentrations of the MTH1 inhibitor TH588. Data shown asaverage ± s.d. of three to six individual experiments, eachperformed in duplicate.

b,MTH1 inhibitors TH287,TH588 and TH650 do not inhibitMutT. Inhibitory potency of TH287, TH588 and TH650 was tested against MutT(9.6nM) and MTH1 (4.75nM)at 100 uMdGTP and various inhibitor concentrations. Data shown as average ± s.d. from two independent experiments.

c,d,Viability (c)and 53BP1 fociformation (d)in U2OS cells overexpressing MutT localized to the mitochondria (MutT-m) or MutTlocalized to both the mitochondria and nucleus (MutT-mn) or with no overexpression(control) treated with 10 uM TH588 for 72 h. Data shown asaverage ± 6s.d. from three independent experiments, **P,0.01,one-way ANOVA. Values represent average±s.e.m. from three independent experiments.

e,Plasma exposure of TH588 after 3 days treatment in C57BL/6 (n53 per time point) and SCID mice (n53 per time point) with subcutaneous injections of 25mg/kg TH588; plasma exposure was measured after the thirdinjection on day 3. The dotted lines indicate the IC50 and IC90 valuesobtained from cell survival invitro in SW480 cells.

f,Growth of visceral metastasis from a malignant melanoma patient in NOD-scid IL2Rcnull(NOG)mice treated once daily with TH588 (30 mg/kg, subcutaneous administration, once daily) orvehicle (n=5 per group).

g, Model for MTH1-dependent survival incancer cells.

图5 TH588通过对MTH1的抑制作用减少肿瘤的生长

a，人的MTH1、MTH2（NUDT15）、NUDT5、NUDT12、NUDT14、NUDT16、dUTPase、dCTPase和ITPA经MTH1抑制剂TH588不同浓度处理后的体外水平活性情况。数据显示为均值±s.d.，来自三到六次独立实验，每次双重重复。

b，MTH1的抑制剂TH287、TH588以及TH650并不对MutT具有抑制作用。TH287、TH588和Th650针对MutT（9.6 nM）和MTH1（4.75nM）的抑制效应在100uMdGTP和各种抑制剂浓度条件下检测。数据显示为均值±s.d.，来自两次独立实验。

c，d，U2OS细胞当在线粒体中过量表达MutT（MutT-m）或同时在线粒体和细胞核中过量表达MutT（MutT-mn）或没有过量表达（对照）经10uMTH588处理72小时后细胞存活率（c）和53BP1集落形成情况（d）。数据为均值±s.d.，来自三次独立实验，**P<0.01，单向方差分析。数值为均值±s.e.m.，来自三次独立实验。

e，在C57BL/6（n=3每个时间点）和SCID小鼠（n=3每个时间点）经皮下注射25mg/kgTH588 3天后的血浆中的TH588情况；血浆暴露两载第三天第三次注射后检测。虚线表示在SW480细胞中体外水平所获得的细胞存活IC50和IC90的数值。

f，恶性黑色素瘤患者内脏转移肿瘤衍生的癌细胞在NOD-颂词等IL2Rγnull（NOG）小鼠移植后在TH588每天一次的处理（30mg/kg，皮下注射）或对照处理（每组5只小鼠）后肿瘤的生长情况。

g，癌细胞中MTH1依赖型存活的模型。

讨论

在此，我们观察到MTH1蛋白是癌细胞存活所必需的，而这种蛋白在未转化的细胞中则不是必需的。为了解释这一现象，我们构建了一个模型，认为癌细胞中氧化还原调节作用的丧失以及ROS会导致氧化性dNTP汇集物的产生，这些汇集物反过来需要MTH1蛋白来阻止其整合作用以及DNA复制后的损伤（图5g）。我们发现在许多细胞中MTH1是过量表达的（扩展数据图7）而且MTH1的催化活性在肺癌组织中表现为显著增加，而这时非致癌基因导致癌症形成的一个例子，而且可能是为阻止氧化性NTPs整合的一种存活性应答。而为什么正常细胞似乎更少依赖MTH1活性的可能原因是与癌细胞相比正常细胞中严格的氧化还原调节作用以及对ROS的完整的细胞周期检验点所形成的（图5g）。我们可以通过癌症细胞可能会适应非平衡性氧化还原状态并为存活而激活有力的抗氧化机制从而在癌症中降低整体ROS水平这些事实来使相对简单的模型变得复杂。所以进行重新平衡或进一步改变氧化还原状态推测可能会成为对MTH1抑制剂产生抗性的机制。

之前已经证实MTH1可以阻止Ras诱导产生对DNA的损伤作用，而在同时出现的一篇报道中发现选择性杀死Ras表达细胞的化合物是通过针对MTH1而起作用的。在此我们发现在SV40大T转染的BJ细胞中类似的细胞对于MTH1抑制剂出现敏感性的现象，就像在额外由Ras转化的细胞中所见到的现象那样（图4i，扩展数据图1，5），说明Ras的表达并不是癌症中MTH1必需性作用的一个主要决定性因素。

在小鼠中MTH1的过量表达会促进小鼠的长寿、减少小鼠的焦虑、并保护小鼠不受3-硝基丙酸诱导产生神经变性的作用。对于Mth1-/-小鼠的病理性检测当江癌症发病率在肺脏、肝脏和胃等进行分组检测发病率时发现癌症的发病率略有上升，而对Mth1基因的破坏会同时在Ogg1-/-小鼠中抑制肺癌的形成。这些数据说明长期MTH1抑制剂处理可能与非极性的副作用相关，类似于在PARP抑制剂中见到的情况。然而，如果考虑到许多抗癌作用蛋白具有必要性以及与目前化疗相关的严重的副作用，MTH1的抑制作用仍然会是一个吸引人的治疗方法。

在此我们展示了首创对于nudix水解酶蛋白家族的抑制剂，这些抑制剂显示出对其他nudix家族蛋白的优异的选择性以及对选择性集合众存在激酶的良好的选择性。我们在MTH1抑制剂存在的条件下，表达了细菌性MutT蛋白，挽救了8-oxodGTPase在细胞中的活性。我们发现MutT的表达会部分恢复细胞存活率并降低DSB的形成（53B1集落；图5）。证实生化活性的恢复可以挽救生物学效应是化合物作用到目标上效应的最佳证据，我们认为这类实验应该得到更为广泛地应用。

结论是我们证实对MTH1的作用形成了一种对新型癌症表型具有致命性的抗癌治疗方法，这种方法的作用目标是非致癌基因，这一作用目标会将癌症中存在的失调的代谢活动和ROS水平转化成为毒性的DNA损伤。（全文完）

04092014-Nature-Article-MTH1-cancer

Title:Stereospecific targeting of MTH1 by (S)-crizotinib as an anticancer strategy

题目：通过克里唑蒂尼（crizotinib）对MTH1的立体特异性作用作为一种抗癌策略

Abstract Activated RAS GTPase signalling is a criticaldriver of oncogenic transformation and malignant disease。 Cellular models of RAS-dependentcancers have been used to identify experimental small molecules, such asSCH51344, but their molecular mechanism of action remains generally unknown。Here, using a chemical proteomic approach, we identify the target of SCH51344as the human mutt homologue MTH1 (also known as NUDT1), a nucleotide poolsanitizing enzyme。 Loss-of-function of MTH1 impaired growth of KRAS tumourcells, whereas MTH1 overexpression mitigated sensitivity towards SCH51344。

Searching for more drug-like inhibitors, we identified the kinase inhibitorcrizotinib as a nanomolar suppressor of MTH1 activity。 Surprisingly, theclinically used (R)-enantiomer of the drug was inactive, whereas the(S)-enantiomer selectively inhibited MTH1 catalytic activity。 Enzymatic assays,chemical proteomic profiling, kinome-wide activity surveys and MTH1 co-crystalstructures of both enantiomers provide a rationale for this remarkablestereospecificity。 Disruption of nucleotide pool homeostasis via MTH1inhibition by (S)-crizotinib induced an increase in DNA single-strand breaks,activated DNA repair in human colon carcinoma cells, and effectively suppressedtumour growth in animal models。