Hppd基因和抑制剂的制作方法(2)

在致敏性评价方面，主要做了bt蛋白与已知致敏原蛋白的氨基酸序列同源性比对，bt蛋白与已知致敏原蛋白无序列相似性，不会增加过敏风险。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。来自其它物种的有关t1r家族基因在至少约50个核苷酸长度内，或者在100、200、500或500个以上的核苷酸长度的区域内与本文实施例中公开的t1r核酸序列或者其保守性修饰的变体具有至少约50％，或者60％、70％、80％或90％的核苷酸序列一致性，或者所编码的多肽在至少约25个氨基酸长度内，或者在50～100个氨基酸长度的氨基酸区域内与本文实施例中公开的t1r多肽序列或者其保守性修饰的变体具有至少约35～50％，或者60％、70％、80％或90％的氨基酸序列一致性。

HPPD基因在拟南芥属中的基因组组构使用按Dellaporta的方法(Dellaporta等人，植物分子生物学通讯(Plant Mol.Biol.Rep.)1:19,1983)从拟南芥属籽苗中制备的基因组DNA进行Southern印迹分析。用限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ消化10μgDNA，然后在0.9％琼脂糖凝胶上分离消化产物，使用VacuGene Ⅺ真空印迹系统(Pharmacia)转移到Duralon-UV膜(Stratagene)上并使用Stratalinker UV交联剂(Stratagene)交联。按下述方法制备HPPD探针(ⅰ)从HPPD/λYes质粒DNA的消化产物中凝胶纯化(使用GeneClean试剂盒，Bio 101,Inc.)Xho 1/SstⅠ片段。该片段含有ATG起始密码子上游的50个碱基序列并延伸到TGA终止密码子上游55碱基的位置；(ⅱ)使用Prime-It Fluor荧光标记试剂盒(Stratagene)标记该片段。使用QuikHyb迅速杂交溶液(Stratagene)使标记的探针于68℃与膜杂交2小时。用0.1×SSC/0.1％SDS于室温下将膜洗一次并于60℃洗两次，然后使用发光器非放射活性检测系统(Stratagene)观察杂交带。

在BamHⅠ和HindⅢ消化产物中，都只有一条在高度严格条件下与探针杂交的带。在EcoRⅠ消化产物中观察到两条带，反映HPPD序列中存在有内部EcoRⅠ位点。这些结果提示HPPD是由拟南芥属中的单拷贝基因编码的。

然后使用引物ATHPPD5F(5′-CCATGGGCCACCAAAACG-3′)和ATHPPD5R(5′-CTGCAGTCATCCCACTAACTGTTTG-3′)从拟南芥属基因组DNA中扩增完整的HPPD编码序列。将所得到的稍大于相应cDNA片段的基因组HPPD片段克隆到pCRⅡ载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen)中并进行序列分析。检测到定位在cDNA序列之核苷酸位置1163-1164处的107bp单个内含子。

核酸、载体、表达系统和多肽在本发明的实践中，使用如在Sambrook等人，1989，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；DNA克隆实用方法，Vol:Ⅰ&Ⅱ,1985(D.N.Glover编辑)；寡核苷酸合成，1984(M.L.Gait编辑)；转录和翻译，1984(Hames和Higgins编辑)；酶学中分子克隆方法的实践指南(Academic Press,Inc.)，和蛋白质纯化原理和实践，第二版(Springer-Verlag，纽约)中详细描述的分子生物学、微生物学、重组DNA及蛋白质生物化学技术。

因此，术语“保守性变体”、“类似物”或“模拟物”是指具有修饰的氨基酸序列的多肽，由此如本文所定义的，所述变化没有使该多肽的(保守性变体的)结构和/或活性产生根本性改变。对于特定的核酸序列，保守性修饰变体是指编码相同或实质上相同的氨基酸序列的核酸序列，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指实质上相同的序列。与昆虫ugt间同源性最低,与家蚕ugt间同源性为41%.ecor i-o片段+m13端含有编码olnpv orf129(ol-129)ol-129同源基因orf,由597 bp个核苷酸组成,在其起始密码子atg上游-64,-24 nt处各有1个tata box,其推测的氨基酸序列与ol-129同源性最高达81%,与ldnpv orf127同源性最低,为40%.明确了orernpv ecor i-o 片段的序列特征,以及orernpv egt 基因特性.。

可使用本文提供的方法和组合物，以常规实验分离从拟南芥以外的植物中衍生的HPPD序列。例如，可在中度严格条件下(例如在65℃2×SSC水溶液中)使包括全部或部分拟南芥属HPPD序列的核酸与衍生于其他种植物的cDNA或基因组DNA杂交，以鉴定HPPD同系物。可从市场上购得衍生于不同种植物的cDNA文库(Clontech,PaloAlto,CA:Stratagene,La Jolla,CA)。另外，也可使用基于PCR的方法扩增来自其他种植物cDNA或基因组DNA的HPPD相关序列。例如可使用下文详细描述的方法在大肠杆菌中表达所鉴定的序列，以进一步证实由相当于HPPC编码序列的序列编码之多肽的酶促活性。因此，衍生于双子叶和单子叶植物的HPPD序列也包括在本发明范围内。

本发明的核酸包括任何长度的含嘌呤和嘧啶聚合物，可以是多聚核糖核苷酸或多聚脱氯核糖核苷酸或混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。其中包括单链和双链分子，即DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA杂合体，以及碱基与氨基酸骨架接合形成的“蛋白质核酸”(PNA)。其中还包括含有修饰的碱基的核酸。可直接从细胞中分离核酸。另外，也可使用化学合成链或基因组材料作为模板，以PCR技术产生本发明的核酸。可使用本文提供的序列信息合成并可进一步设计用于PCR的引物，以根据需要导入新的适当的限制位点，从而有利于将序列掺入适于重组表达的给定载体中。

(b)(甲基)丙烯酸二烷基氨基烷基酯的季铵物质、或酸的盐、或前述酸盐与(甲基)丙烯酰胺的聚合物或共聚物(如，丙烯酸二甲基氨基丙酯与丙烯酰胺的甲基氯的季铵物质)。更优选的α，β-不饱和羧酸的烷氨基烷基酯包括(甲基)丙烯酸二甲氨基乙酯、(甲基)丙烯酸β-氨基乙酯、(甲基)丙烯酸叔丁基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸二丙氨基乙酯、(甲基)丙烯酸甲氨基乙酯、(甲基)丙烯酸n-甲基-n-羟乙基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸n-(单正丁基)-4-氨基丁酯、甲基丙烯酰氧基乙氧基乙胺以及它们的各种混合物。在前述物质中，优选使用以下物质中的任何一种(甲基)丙烯酸二烷基氨基烷基酯的季铵物质或酸盐的聚合物、或前述物质与(甲基)丙烯酰胺的共聚物、二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酰胺的季铵物质的聚合物、其酸盐或前述物质与(甲基)丙烯酰胺的共聚物。

本发明还提供包含已公开的HPPD序列或其衍生物或片段的核酸载体。已描述了许多适于在各种真核和原核宿主中复制和/或表达的载体，包括质粒和真菌载体。非限制性的例子包括pKK质粒(Clontech)、pUC质粒、pET质粒(Novagen,Inc.,Medison,WI),或pRSET或pREP(Invitrogen,San Diego,CA)，并可使用本文公开或列出的，或相关领域技术人员已知的方法转化许多合适的宿主细胞。重组克隆载体常常包括一个或多个用于克隆或表达的复制系统，一个或多个用于在宿主中选择的标记，如抗生素抗性标记，以及一个或多个表达盒。可用适当的方法如电穿孔、CaCl2介导的DNA摄入、真菌感染、微粒轰击、显微注射或其他已建立的方法转化/转染/感染适当的宿主细胞。

适当的宿主细胞包括细菌、古细菌、真菌、特别是酵母，及植物和动物细胞，特别是哺乳动物细胞。其中特别有用的是大肠杆菌、枯草杆菌、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母、粟酒裂殖酵母、SF9细胞、C129细胞、293细胞、链孢霉属及CHO细胞、COS细胞、Hela细胞和无限增殖化哺乳动物髓样和淋巴样细胞系。优选的复制系统包括M13、C01E1、SV40、杆状病毒、λ、腺病毒等。已分离了许多转录起始和终止调节区，并显示它们对异源蛋白质在各种宿主中的转录和翻译是有效的。这些区域的实例、分离方法、操作方法等都是本领域已知的。在适当的表达条件下，可使用宿主细胞作为重组产生的HPPD衍生的肽和多肽的来源。

有利的是，载体也可包含可操作地连接到HPPD部分上的转录调节元件(即启动子)。启动子可任选地含有操纵子部分和/或核糖体结合位点。与大肠杆菌相容的细菌启动子的非限制性实例包括trc启动子、β内酰胺酶(青霉素酶)启动子、乳糖启动子、色氨酸(trp)启动子、阿拉伯糖BAD操纵子启动子、λ衍生的P1启动子和N基因核糖体结合位点，以及从trp的序列衍生的杂合tac启动子和lac UV5启动子。核苷酸合成抑制剂酵母启动子的非限制性实例包括3-磷酸甘油酸激酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、半乳糖激酶(GAL1)启动子、半乳糖差向异构酶启动子和醇脱氢酶(ADH)启动子。适于哺乳动物细胞的启动子包括但不只限于病毒启动子和得自猿猴病毒40(SV40)、Rous肉瘤病毒(RSV)、腺病毒(ADV)和牛乳头瘤病毒(BPV)的启动子。哺乳动物细胞还可能需要终止子序列和聚A加入序列，并且还可包括提高表达的增强子序列。另外还希望有引起基因扩增的序列。此外，还可包括有利于重组产物从细菌、酵母和动物细胞等细胞中分泌的序列，如分泌信号序列和/或激素原前区域序列。

与昆虫ugt间同源性最低,与家蚕ugt间同源性为41%.ecor i-o片段+m13端含有编码olnpv orf129(ol-129)ol-129同源基因orf,由597 bp个核苷酸组成,在其起始密码子atg上游-64,-24 nt处各有1个tata box,其推测的氨基酸序列与ol-129同源性最高达81%,与ldnpv orf127同源性最低,为40%.明确了orernpv ecor i-o 片段的序列特征,以及orernpv egt 基因特性.。通过对粉虱、小菜蛾高效的球孢白僵菌hfw-05 几丁质酶基因的克隆及序列分析,旨在从分子水平上了解hfw-05 菌株的几丁质酶特性.根据已发表的几丁质酶基因序列(eu828354)设计几丁质酶基因全长引物,扩增 hfwbbchit1 全长基因,与大肠杆菌(escherichia coli)克隆载体 pmd19-t 连接获得含有 hfwbbchit1 全长基因的重组质粒 pmdchit1 并测序.该基因的编码区包括1 047 bp,编码了348个氨基酸,分子量约为36.795 kda,进行同源性比较分析结果表明:其基因序列与球孢白僵菌菌株 ncim1216 几丁质酶基因(eu828354)和球孢白僵菌菌株 bb0062 几丁质酶基因(ay145440)的核苷酸同源性最高,同源性达到98%.氨基酸序列与球孢白僵菌菌株 bb0062 几丁质酶(aan41259)同源性达到99%.。2.转铁蛋白受体2（tfr2） tfr2 是kawabata从tf 细胞和hl-60细胞cdna 文库中克隆出的tfr1 同源基因，同tfr1 有45％ 的相同序列，基因定位于染色体7q22位置，有两个编码转录物。

可从野生型或突变体拟南芥属细胞中，或已导入或表达了HPPD衍生的蛋白质编码序列的异源生物体或细胞(包括但不只限于细菌、真菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞)中分离本发明的HPPD衍生的多肽，包括功能保守性HPPD变异体。此外，这些多肽可以是重组融合蛋白质的一部分。也可使用市售的自动合成设备和方法化学合成多肽，这些方法包括但不只限于专有固相合成、部分固相方法、片段缩合或经典的溶液合成方法。

“纯化”HPPD多肽是指在不受表达多肽的细胞中其他成份干扰情况下，以可检测其酶促活性的形式分离HPPD多肽。纯化多肽的方法是本领域已知的，其中包括但不只限于制备性圆盘凝胶电泳、等电聚焦、HPLC、反相HPLC、凝胶过滤、离子交换和分配层析，以及逆流分配法。在某些情况下，最好在重组系统中产生多肽，其中HPPD蛋白质含有便于纯化的附加序列标记，例如但不只限于聚组氨酸序列。然后在适当的固相基质上层析，以从宿主细胞的粗制溶胞产物中纯化所需的多肽。或者，可使用抗HPPD或由之衍生的肽的抗体作为纯化试剂。其他纯化方法也是适用的。