Hppd基因和抑制剂的制作方法(4)

优选实施方案的描述下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1拟南芥属HPPD在大肠杆菌中的表达完成下述实验以证明大肠杆菌中高水平酶促活性拟南芥属HPPD的产生。

42.cdna文库和基因组文库有何异同点1基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的dna序列2基因组文库的克隆的是全部遗传信息，不受时空影响，cdna文库克隆的是不完全的编码dna序列，因它受发育和调控因子的影响3基因组文库中的编码基因包含内含子和外显子，而cdna文库克隆的不含内含子的基因。为了产生全长的ht1r1表达构建体，通过重叠pcr，将在克隆的ht1r间隔序列(登录号al159177)中确认的两个5’编码外显子合并，然后将其连接到5’截断的睾丸cdna克隆。运用smart技术成功构建了虎纹蛙(hoplobatrachus rugulosus)皮肤组织全长cdna文库.根据蛙科动物抗菌肽的信号肽保守序列设计简并引物,以pcr法成功从文库中随机挑选的阳性克隆中筛选出2个抗菌肽cdna序列,命名为tigerinin-hr1和tigerinin-hr2.这2个抗菌肽cdna序列是首次从虎纹蛙皮肤组织中克隆出的抗菌肽编码基因.。

使用上述引物并以从上述cDNA文库中分离的HPPD序列作为模板完成PCR反应。反应混合物(100μl)含有下列成分2ng质粒DNA、1XPCR缓冲液、各200mM三磷酸脱氧核苷酸、2.5单位Ampli Tag DNA聚合酶(Perldn Elmer)、13pmol引物ATHPPD6F、和11pmol引物ATHPPD6F。将反应混合物加热至95℃保持2分钟，然后使用30次循环进行扩增95℃,1分钟；55℃,2分钟；72℃,1.5分钟。然后于72℃保温反应7分钟。

扩增1.3Kb PCR产物。在1.2％Nu Sieve GTG凝胶(FMC)上分辨并纯化(Gene Clean,Bio 101)该片段。用NcoⅠ消化经纯化的片段并连接到NcoⅠ消化的、碱性磷酸酶处理的pKK233-2载体(Clontech)中。将连接混合物转化到DH5α文库效率感受态细胞(GibcoBRL)中。当在含氨苄青霉素的LB中培养过夜时，根据红褐颜色的生成鉴定表达HPPD的转化体。

还使用空pKK233-2载体转化DH5α细胞制备了转化体，以在酶检测试验中用作对照。

B．在大肠杆菌中产生褐色色素和尿黑酸观察生长在固体培养基上的用拟南芥属HPPD基因转化的大肠杆菌菌落和液体培养物和液体培养物产生的褐色色素。未被转化的大肠杆菌或用对照载体转化的大肠杆菌未见有相似的褐色色素形成。在培养基内添加酪氨酸可增加褐色色素(其表现在450nm处有特征性吸收)的形成(图2)。

此外，黑尿还可见于酚中毒、黑色毒瘤、尿黑酸病。玳瑁颜色丰富，包括黑、白、黄及褐色，往往在浅底色上呈现深色圆或浑圆形色素小球（黄、褐或白、黑组合），这与fe3+、cu2+、mn2+等离子的存在有关。[產品介紹]熊果美白，淡化色斑，提升膚色迅速滲入肌膚，在不影響細胞增殖濃度的同時，能有效地抑制皮膚中的生物酪胺酸(tyrosinase)活性，阻斷黑色素的形成，通過自身與酪胺酸直接結合，加速非色素的分解與代謝，從而減少皮膚色素沉澱，去除色斑和雀斑，而且對黑色素細胞不產生毒害性、刺激性、致敏性等副作用，同時還有殺菌、消炎的效果。

使用基于HPLC的方法直接检测尿黑酸，则进一步证实了这一结论。检测尿黑酸的HPLC条件与Denoya等人(细菌学杂志176:5312,1994)所述的条件完全相同。HPLC系统由Waters 510释放组件(WatersAssoc.,Milford,MA)、Waters996光电二极管阵列检测器、WISP710B自动加样器和Waters840数据积分系统组成。使用与装有C18树脂的不锈钢保护柱相连的Phenomenex Spherisorb 5ODS(1)C18反相柱(颗粒大小为5mm,250×4.6mm内径)。流动相(10mM乙酸∶甲醇；85∶15 V/V)的流速为1ml/分钟。波长定在292nm。与100ml冰醋酸混合以酸化培养液样品(1ml)并离心澄清之。将50ml混合物注入柱顶。将相当于尿黑酸的洗脱峰与尿黑酸标准品比较以鉴定并定量分析之。

此外，黑尿还可见于酚中毒、黑色毒瘤、尿黑酸病。大肠杆菌属肠杆菌科，为有动力或无动力的革兰氏染色阴性杆菌，具有分解乳糖、产酸产气的特点。 诊断依据 2.鉴别诊断 （1）急性膀胱炎 （2）泌尿系结核 3.进一步检查 （1）尿培养（2）尿找结核菌 （3）血肌酐、双肾b超及肾盂造影 （4）女性患者可行妇科检查 4.治疗原则 （1）用药前应先作尿培养+药敏试验，在未得到尿培养结果前应选用对革兰阴性杆菌有效的药物。

C．HPPD活性的检测于30℃用溶于50mM磷酸钾缓冲液(pH7.3)中的0.1mg/ml溶菌酶处理大肠杆菌转化体10分钟。超声(3次，每次5秒钟，使用Vibra Cell超声发生器，Sonics和Material,Inc.,Danbury,CT)并离心分离提取物。在已用50mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)平衡的Econo-Pac 10DG柱(Bio-Rad,Richmond,CA)上使上清液脱盐。使用含有脱盐的HPPD的提取物进行HPPD活性检测。

根据从14C-羟苯基丙酮酸释放的14CO2的俘获量测定HPPD酶促活性(Schulz等人，FEBS Letts,318:162,1993；Secor，植物生理学(PlantPhysiol.)106:1429,1994)。在20ml闪烁瓶中进行反应，每个小瓶盖以血清塞，借以悬浮含有50μl氢氧化苄乙氧铵(benzethonium hydroxide)的聚丙烯孔。每450μl反应混合物含有50mM磷酸钾缓冲液(pH7.3),50μl新鲜制备的150mM还原态谷胱甘肽和3mM二氯靛酚的1∶1(V/V)混合物、2500单位过氧化氢酶，以及细菌提取物(HPPD的来源)。加入所指出的酶抑制剂。加入按Secor(1994，上述文献)所述方法制备的14C-羟苯基丙酮酸(50μl2mM溶液)以开始反应，反应于30℃进行30分钟。加入100μl4N硫酸终止反应并将混合物继续保温30分钟。在闪烁计数器中计数俘获到氢氧化苄乙氧铵中的放射活性。

结果表明，用拟南芥属HPPD基因转化的大肠杆菌细胞表达了很高水平的HPPD活性，即2.7μmol/mg蛋白质/小时。相反，在未被转化的或对照大肠杆菌细胞中则未能检测到HPPD活性。再者，发现HPPD活性是对硫康三酮的抑制作用有敏感性(图4)。可见大于1μM的硫康三酮几乎完全抑制HPPD活性。引起活性的50％抑制所需的硫康三酮浓度为100nM。实施例2高流通量筛选试验化合物以鉴定HPPD抑制剂使用下述方法，以高流通量方式鉴定HPPD抑制剂。

在加有100μg/ml氨苄青霉素的Luria培养液中37℃过夜培养用实施例1中所述拟南芥属HPPD基因转化的大肠杆菌。

将1升含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM酪氨酸的熔化的LB琼脂冷却到50℃。然后加入0.1ml过夜大肠杆菌培养物，并将150ml混合物倒入各个9×9无菌Sumilon生物托盘(Vangard International,Nepture,NJ)中。

使平板固化并干燥30分钟。将试验化合物(多达25μl)加于试验平皿的样品孔(144孔/平皿，直径5cm,12个×12排)或加样点(6×96种化合物/平皿)。将平皿37℃保温过液。

监测(ⅰ)大肠杆菌的生长及(ⅱ)褐色色素强度，以记分评定各平皿。将其中细菌细胞是活的但色素减少的区带记为HPPD抑制剂阴性。

本文提到的所有专利、专利申请、文章、出版物及试验方法均列入本文作为参考。

此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。此外应理解，在阅读了本实用新型表述的内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本实用新型并不局限于上述实施方式，如果对本实用新型的各种改动或变型不脱离本实用新型的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本实用新型的权利要求书和等同技术范围之内，则本实用新型也意图包含这些改动和变型。

权利要求

1．纯化的分离的编码植物HPPD的核酸。

2．如权利要求1中限定的核酸，其衍生于拟南芥。

3．如权利要求2中限定的核酸，其中所说的核酸选自SEQ ID N0:1，其序列保守变异体和其功能保守变异体。

4．包含可操作地连接到转录调节元件上的权利要求3的核酸序列的DNA载体。

5．包含如权利要求4中限定的DNA载体的细胞，其中所说的细胞选自细菌、真菌、植物、昆虫及哺乳动物细胞。

6．如权利要求5中限定的细胞，其中所说的细胞是细菌细胞。

7．如权利要求5中限定的细胞，其中所说的细胞是植物细胞。

8．包含权利要求7中限定的细胞的种子。

9．包括由权利要求2中限定的DNA编码的蛋白质的HPPD蛋白质。

含氮的杂环化合物中 ,一元杂原子取代物吡啶 ,1, 3—二氮取代的嘧啶均能完全氧化矿化 ,均一三氮杂苯类除草剂的最后光催化氧化产物为六元三聚氰-( )酸 —[n = c（ oh ）] ,它也是所有研究的目标化合物中唯一不能完全矿化的化合物物种。１．对Ｂ一胡萝ｈ素及其氧化降解总产物进行生理活性测定，通过形态观察，０ 一胡萝ｂ素氧化降解总产物可以使癌细胞表面粗糙，细胞整体感差，易脱落， 迸一步，细胞贴壁不紧，死亡，并成碎片游离于培养液中。通过氧同位素示踪实验，发现在二氧化钛光催化氧化醇类化合物的反应中，产物中的氧原子完全来自于分子氧，提出了二氧化钛光催化氧化过程中的氧原子转移机理。

11．如权利要求10中限定的方法，其中所说的微生物细胞是大肠杆菌。

12．如权利要求10中限定的方法，其中所说的监测包括测定所说的培养物在450nm处的吸光率。

13．如权利要求10中限定的方法，其中所说的监测包括检测褐色色素的形成。

48.调节味觉感觉的化合物的鉴定方法，该方法通过对结合到、激活、抑制和/或调节细胞所表达的受体的化合物进行鉴定来进行，所述细胞稳定表达权利要求23～26任一项所述的一个或一个以上的受体。从蛋白酶里萃取一种高渗透、高疗效的提取液，能抑制细胞酪氨酸酶的合成，快速凝固人体肌肤的黑色素、黄色素，同时修复受损细胞，蛋白凝固色素提取液直接作用于色素皮肤角质层，其高渗透性可以穿透至皮肤深层，自动识别、分辨、捕捉皮肤变异色素并选择性的在瞬间凝固，将其提取至皮肤表皮，并对病变部位的细胞进行同步修复，增强皮肤细胞组织的活力，蛋白凝固色素提取技术能准确定位、分辨黑色素深浅、大小，祛斑更加快捷，对皮肤完全没有损伤。色素细胞有黑、黄、红三种，黑色素细胞和黄色素细胞存在于普遍鱼类的皮肤中，红色素细胞多见于热带奇异的鱼类局部皮肤中，光彩细胞中不含色素而含鸟粪素的晶体，有强烈的反光性，使鱼类能显示出银白色闪光，有些鱼类生活在海洋深处或昏暗水层，具有另一种皮肤衍生物—发光器腺细胞，能分泌富含磷的物质，氧化后发荧光，以诱捕趋光性生物，或作同种和异性间的联系信号，如深海蛇鲻、龙头鱼和角鮟鱇中的一些种类。

15．变异体HPPD蛋白质，其中所说的蛋白质是除草剂抗性的。

16．如权利要求15中限定的变异体HPPD蛋白质，其中当所说的变异体HPPD蛋白质在为维持生存力而需要HPPD活性的细胞中表达时，则表现有(ⅰ)单独即足以维持表达它的细胞的存活力的催化活性；或与也在该细胞中表达的任何除草剂抗性HPPD变异蛋白质结合的催化活性，其可以是与第一种HPPD变异体蛋白质相同或不同的，并足以维持表达该蛋白质之细胞的存活性；以及(ⅱ)比野生型HPPD有更大除草剂抗性的催化活性。

17．如权利要求15中限定的变异体HPPD蛋白质，其中所说的蛋白质得自于拟南芥。

18．编码如权利要求15中限定的变异体HPPD蛋白质的核酸。

19．包括如权利要求18中限定的核酸的DNA载体。

20．包含如权利要求19中限定的DNA载体的细胞，其中所说的细胞选自细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞。

21．如权利要求20中限定的细胞，其中所说的细胞是细菌细胞。

22．如权利要求20中限定的细胞，其中所说的细胞是植物细胞。

23．包含如权利要求22中限定的细胞的种子。

24．为植物提供除草剂抗性的方法，所说的方法包括在适于在所说的植物中表达所说的核酸条件下，将编码如权利要求16中限定的除草剂抗性HPPD变异体的核酸导入所说的植物中。

25．控制杂草的方法，其包括在控制杂草有效量的所说的除草剂存在下，培养含有除草剂抗性HPPD基因的作物。

全文摘要

公开了得自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的编码4－羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的核酸序列。另外还公开了含有编码HPPD的DNA的载体及被转化的细胞。本发明还描述了鉴定除草剂抗性HPPD和作为HPPD抑制剂的除草剂的方法，以及赋予植物以除草剂抗性的方法。再者，还描述了控制杂草的方法。

文档编号C12N15/09GK1238008SQ97198011

公开日1999年12月8日 申请日期1997年7月25日 优先权日1996年7月25日

发明者S·斯杜尔纳, L·M·希拉雅玛, B·辛格, N·巴斯康姆 申请人:美国氰胺公司