Hppd基因和抑制剂的制作方法

专利名称：Hppd基因和抑制剂的制作方法

发明的领域本发明涉及编码4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的DNA，HPPD抑制性除草剂，以及筛选化合物以鉴定HPPD抑制性除草剂的方法。本发明还涉及对除草剂的抑制作用有抗性的HPPD变异体，筛选HPPD变异体的方法，以及含有除草剂抗性HPPD的植物。

发明的背景在植物中，4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD,EC1.13.11.27)是生物合成质体醌和生育酚的关键酶。4-羟苯基丙酮酸(通过莽草酸途径衍生于分支酸)被氧化并被HPPD脱羧形成尿黑酸(Fiedler和Schultz，植物生物学进展(Dev.Plant Biol.)8:537,1982；Fiedler等人，Planta 155:511,1982)。然后尿黑酸发生聚异戊二烯化和脱羧而产生一系列质体醌和生育酚。

本病是一种遗传性氨基酸代谢障碍，为常染色体隐性基因遗传，因患者肝脏不能合成笨丙氨酸羟化酶，以致食物中的苯丙氨酸不能被氧化成酷氨酸，只能在肾脏中被转氨酸变成苯丙酮酸。毒理研究遗传毒性：细菌突变试验、小鼠淋巴瘤突变试验、在体小鼠骨髓和体外人淋巴细胞遗传学试验结果表明，在有或无代谢激活存在时，舍曲林均未出现遗传毒性。1.遗传毒性：有实验表明，dehp会损伤小鼠肝脏及脑组织中的遗传物质，高剂量（1000mg/kg、2000mg/kg）的dehp会增加肝脏细胞遗传物质的突变率，诱发小鼠细胞产生染色体畸变。

由于质体醌和生育酚是植物的基本化合物，所以该酶的抑制剂是潜在的除草剂。目前已证明三酮类HPPD抑制剂具有除草活性(Prisbylia等人，Brighton Crop Protection Conference:Weeds,British Crop Protection Council,Surrey,UK,pp 731-738,1993；Schulz等人，FEBS Letts.318:162,1993)。玉米选择性硫康三酮(sulcotrione)(2-(2-氯-4-甲磺酰苯甲酰基)-1,3-环己二酮引起敏感植物的强烈退色，伴有类胡萝卜素和叶绿素的丢失及八氢番茄红素和酪氨酸的增加(Barta等人，Pest.Sci.45:286,1995；Soeda等人，Pestic.Biochem.Physio1.29:35,l987,Mayonado等人，Pestic.Biochem.Physiol.35:138,1989)。用硫康三酮处理浮萍属严重地抑制了生长，并可用尿黑酸消除除草作用。已显示从玉米中提取的部分纯化的酶将受到硫康三酮的严重抑制，计算的IC50为45nM(Schulz等人，1993，上述文献)。对从稗子中部分纯化的HPPD的分析(Echinochloa crus-galli L.)显示，硫康三酮是该酶的强有力的竞争性抑制剂，其Ki值为9.8nM(Secor，植物生理学(Plant Physiol.)106:1429,1994)。加拿大专利申请No.2,116,421公开了鉴定由2-苯甲酰环六胺1,3-二酮衍生的HPPD抑制剂的方法。

从T-DNA接尾标记的拟南芥属(Arabidopsis)群体中分离的白化突变体(psdl)最初是借助严重的色素缺陷选择的，后者被认为是由于类胡萝卜素生物合成基因的缺陷造成的(Norris等人，植物细胞(Plant Cell)7:2139,1995)。当白化psdl突变体在MS2培养基上发芽并继后移入加有4-羟苯基丙酮酸(OHPP)或尿黑酸(HGA)的MS2培养基中生长时，植物在HGA上变绿，但在OHPP上则没有变绿。进一步分析这种突变体表明，引起白化表型的缺陷并不是直接由于类胡萝卜素生物合成酶的突变，而是由于阻止类胡萝卜素生物合成所必需的质体醌生物合成的HPPD的突变所致。

尽管这一途径在植物中很重要，但以前尚没有分离出编码这种质体醌和生育酚生物合成所需的植物酶的基因。因此，本领域需要用于提供HPPD基因、用作除草剂的HPPD抑制剂，以及除草剂抗性HPPD变体的方法和组合物。本发明人已分离了编码植物HPPD的基因，在大肠杆菌中表达了该基因，并已证明了细菌表达的植物HPPD是有酶促活性的，而且其酶促活性是受三酮除草剂抑制的。

附图的简要说明

图1显示拟南芥4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(At HPPD)的氨基酸序列，并将该序列与得自小鼠、人、猪和除虫链霉菌(S.Aver)的相关序列一一对齐给出。

图2是图解说明由用拟南芥属HPPD基因(“拟南芥属”)转化的大肠杆菌生产褐色色素，并与用对照载体(“质粒”)转化的大肠杆菌相比较。显示向培养基中加入渐增浓度的酪氨酸对色素形成的影响。

此外，黑尿还可见于酚中毒、黑色毒瘤、尿黑酸病。大肠杆菌属肠杆菌科，为有动力或无动力的革兰氏染色阴性杆菌，具有分解乳糖、产酸产气的特点。冰旃基薅基酸:胺/摩尔比环化温度,℃图 酸胺比对产物缓蚀率的影响图 反应温度对产物缓蚀率的影响. .由图 可知,当酸胺摩尔比为 : 时,产物的缓由图 可知,随着环化反应温度的升高,产物缓蚀效率达到最大值,在其左右均有下降趋势。

谷胱甘肽过氧化物酶( glutathione peroxidase, gpxs)是植物体内清除活性氧的主要酶，与植物抗逆性紧密相关，张蕾等(2015)从小麦中克隆出 gpx 基因，并将其转入农杆菌中，便于遗传转化。但当乙醛脱氧酶2正常基因发生变异之后，便会使该酶失去活性，从而导致饮酒后血中的乙醛浓度增高6倍多，长期酗酒，体内的乙醛就会蓄积，最终可能导致肝细胞发生癌变。camp的浓度是由腺苷酸环化酶(ac)的活性控制的，也就是说，乳糖的吸收受渗透酶和amp环化酶的控制，调节蛋白通过磷酸化的形式和腺苷酸环化酶（ac）或渗透酶结合，分别使腺苷酸环化酶活化或使渗透酶失活。

发明的概要本发明提供编码植物4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)，特别是衍生于拟南芥HPPD的纯化的分离的核酸，及其序列保守变体和功能保守变体；含有与转录调节元件可操作地连接的HPPD编码核酸的载体；含有HPPD载体的细胞，其中包括但不只限于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞。在一个实施方案中，提供了高水平表达植物HPPD的细菌细胞。另外本发明还包括HPPD多肽和由之衍生的酶促活性片段。

在另一个方面，本发明提供按下述步骤完成的鉴定除草剂/HPPD抑制剂的方法(a)提供表达植物HPPD的微生物细胞；(b)于存在试验化合物的条件下培养细胞以形成试验培养物，并在没有试验化合物的条件下培养细胞以形成对照培养物；(c)监测试验和对照培养物中尿黑酸或其氧化产物的水平；并且(d)鉴定相对于对照培养物的试验培养物中，作为抑制HPPD的化合物的降低尿黑酸或其氧化产物水平的任何化合物。在上述方法中，例如通过检测所说的培养物在450nm处的吸光率，或肉眼检查褐色色素的形成以完成监测步骤。或者，也可鉴定作为抑制试验培养物生长之化合物的抑制剂，其中通过向培养物中加入尿黑酸来逆转抑制作用。

再一个方面，本发明提供按下述步骤完成的鉴定除草剂抗性HPPD变体的方法；

(a)提供表达植物HPPD的细胞群体；(b)诱变所说的细胞群体；(c)在抑制非诱变的细胞生长的条件下，使所说的诱变细胞群体与除草剂接触；(d)根据细胞生长和/或色素形成情况回收对所说除草剂的抑制作用有抗性的细胞；并且(e)检测所回收的细胞中的编码HPPD的核酸序列。或者，亦可在体外对编码HPPD的DNA进行随机或位点特异性诱变，然后在异源细胞中表达并筛选或选择表现除草剂抗性的细胞。

再一个方面，本发明包括有除草剂抗性的变异的HPPD蛋白质。当除草剂抗性HPPD变异蛋白质在为维持生存力而需要HPPD活性的细胞中表达时，则表现有(ⅰ)单独即足以维持表达它的细胞的存活力的催化活性；或与也在该细胞中表达的任何除草剂抗性HPPD变异蛋白质结合的催化活性，其可以是与第一种HPPD变异体蛋白质相同或不同的，并足以维持表达该蛋白质的细胞的存活性；以及(ⅱ)比野生型HPPD有更大除草剂抗性的催化活性。

还提供了编码除草剂抗性HPPD变体的核酸，包括该核酸的DNA载体，含有编码变体HPPD的载体的细胞。例如在导入及选择任何其他所需的基因的质粒和方法中，可使用编码除草剂抗性HPPD变体的基因作为遗传标记。

另一个方面，本发明提供向细胞或细胞群体，特别是植物细胞或细胞群体如种子赋予除草剂抗性的方法。突变HPPD基因，特别是拟南芥HPPD基因，以改变除草剂抑制HPPD的酶促活性的能力。将突变的基因克隆到适合的表达载体中，并在以足够水平被表达的条件下将基因转入除草剂敏感性细胞中，以为细胞提供除草剂抗性。

本发明还包括控制杂草的方法，其中培养包含本发明的除草剂抗性HPPD基因的作物，并用控制杂草有效量的除草剂处理之。发明的详细描述本发明包括编码植物4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的分离的，纯化的核酸，产生酶促活性HPPD的表达系统，以及鉴定HPPD抑制剂的筛选方法。

本发明还包括筛选和产生对除草剂的抑制作用有抗性的植物HPPD变体的方法、编码这些变体的DNA，包括这些DNA的载体、HPPD变体蛋白质，以及表达这些变体的细胞。另外还提供了表达这些变体以在植物中产生除草剂抗性的方法和控制杂草的方法。编码拟南芥属HPPD的基因的分离和特性鉴定本发明人已使用下述方法分离并测序了编码拟南芥HPPD的基因。简单地说，使用基于PCR的方法(Amaravadi等人，生物技术(Biotechniques)16:98,1994)筛选拟南芥λYes cDNA文库(Elledge等人，美国国家科学院院报88:1731,1991)。

引物基于同源于哺乳动物HPPD序列的拟南芥属EST序列(GenBank ID No:T20952)合成称为ATHPPD1F的正向引物(5′-CGTGCTCAGCGATGATCAGA-3′)，和称为ATHPPD1R的反向引物(5′-CGGCCTGTCACCTAGTGGTT-3′)。

使用1μl等份(含有3×106pfu/ml)的cDNA噬菌体文库作为模板DNA以聚合酶链反应(PCR)评价引物。为进行PCR反应，50μl反应混合物含有1×PCR缓冲液、各200mM三磷酸脱氧核苷、1.25单位AmpliTaq DNA聚合酶(均购自Perkin Elmer)和各7.5pmole引物。将反应混合物加热至95℃2分钟并进行35次扩增循环95℃1分钟，48℃2分钟，72℃1分钟30秒。然后于72℃保温7分钟。产生112bp预测大小的片段。将该片段克隆到pCRⅡ载体(TA克隆试剂盒，Invitrogen)并测序，发现其完全相同于拟南芥属EST序列(在被报导的EST序列中加入了3个尚未确定的残基)。

包虫病流调工作及包虫病防治：对我县五个乡镇16个村进行了成人b超筛查3200人，学生b超筛查及血清监测2200人，发现病人1例，犬粪监测320份，阳性16份，啮齿类动物(鼠)1000只，阳性7只，牛脏器监测500头，阳性6头，同时将信息采集录入系统。于靠近酒精灯处打开平皿盖约30°，右手将环伸进平皿，将菌种点种在平板边缘一处，轻轻涂布于琼脂培养基边缘（如图2），抽出接种环，盖上平皿盖，然后将接种环上多余的培养液在火焰中灼烧，打开平皿盖约30°伸入接种环，待接种环冷却后，再与接种液处轻轻接触，开始在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖。结果 2002年1406份血清标本中，抗体阳性16份，阴性1390份，阳性率为1.14%(16/1406)(16例中igm阳性12例，igg阳性2 例，igm、igg均阳性者2例)。

序列分析使用Wizard DNA纯化系统(Promega)制备用于测序的模板DNA。使用fmol DNA测序系统(Promega)进行测序反应，并在Hydrolink Long Ranger(AT Biochem)凝胶上进行序列胶电泳。从cDNA文库中分离含HPPD质粒的插入段，并使用除一系列内部引物外的，在XhoⅠ克隆位点的相反侧与λYes载体杂交的两个引物上述ATHPPD1F和ATHPPD1R；和ATHPPD2F(5’-CTTCTACCGATTAACGAGCCAGTG-3’)；ATHPPD2R(5’-CACTGGCTCGTTAATCGGTAGAAG-3’)；ATHPPD3F(5’-TCCATCACATCGAGTTCTGGTGCG-3’)；ATHPPD3R(5’-AAAAGGAATCGGAGGTCACCGGA-3')；ATHPPD4F(5’-CTGAGGTTAAACTATACGGCGA-3’)；及ATHPPD4R(5′-TCGCCGTATAGTTTAACCTCAG-3′)进行序列测定。对两条链进行序列分析以进一步证实所有的序列信息。使用Wisconsin Package，Version 8.0(Genetics计算机集团，Madison，Wisconsin)中的软件完成HPPD核苷酸序列的翻译，序列比较及多个序列排列。