新型环二核苷酸受体及其激动剂或抑制剂筛选的方法和试剂盒与流程

方法: 采用pcr技术扩增hpo205和cytc编码基因, 分别将其构建y2h质粒pdbleu和ppc86的重组载体. 应用y2h技术将二者的重组质粒共转染酵母mav203进行鉴定, 同时用gst-pull down方法对其验证.。对于本领域技术人员，根据基因重组技术的生产方法是众所周知的，简单地说，可将含编码所需人血白蛋白基因的载体导入宿主细胞使之转化。采用了基因芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用，用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，在基因组药学（pharmacogenomics）领域带动新药的研究和开发。

背景技术：

2．3黑素瘤的疫苗治疗 肿瘤疫苗是直接应用肿瘤抗原进行主动免疫治疗的一种方法，目标是诱导ctl对抗原递呈细胞表面hlai型分子上肿瘤抗原的识别，活化cd4+辅助t细胞，发挥免疫记忆功能。他首次发现阻断ctla-4能够激活免疫系统的t细胞攻击癌细胞，同时研发出世界上第一种用于免疫-肿瘤疗法的ctla-4抗体。下列人体免疫细胞不能识别该类病毒的是（）a． b细胞b．吞噬细胞c．t细胞d．效应b细胞（浆细胞）29．不能获得对传染病抵抗力的是（ ）a．服用抗体b．接种疫苗c．输入某种抗体d．感染病原体30．风湿性心脏病、系统性红斑狼疮等一类疾病是（）a．病原体感染机体而引发的疾病，有传染性b．机体免疫功能不足或缺乏而引发的疾病、无传染性c．人体免疫系统对自身的组织和器官造成损伤而引发的疾病d．已免疫的机体再次接受相同物质的刺激而引发的疾病第Ⅱ卷（选择题共40分）1、（12分）下图甲示动物某一结构模式图，图乙是图甲中某一结构的亚显微结构模式图。

环二核苷酸的受体被认为是位于细胞内的内质网(ER)上的蛋白STING亚型1，这个受体蛋白是由Tmem173基因所编码产生。但由于细胞外环二核苷酸不能直接穿透细胞膜，而内质网又在细胞质内，外源性的环二核苷酸是如何通过细胞膜结构来激活在内质网上的受体蛋白STING亚型1一直未知。因此现有的理论体系不能解释外源性的环二核苷酸是如何激活机体的免疫反应的，这导致在筛选环二核苷酸抑制剂和激活剂时为了使待筛选药物接触到细胞内质网上的STING亚型1，需要对细胞进行细胞膜通透步骤或者用脂质体来包裹待筛选药物进行转染，这大大降低了筛选的效率及可筛选药物的范围(例如待筛选药物需要可以被脂质体所包裹)，同时也限制了进一步优化外源性的环二核苷酸作为疫苗佐剂以及抗肿瘤免疫治疗的应用。

实验步骤：通过基因克隆方法获得重组病毒表达载体→转染包装细胞系，扩增并分离得到重组病毒颗粒→纯化并滴定病毒液→转导目的细胞（含有病毒特异性的受体）→从培养基中移除病毒→检测基因表达或沉默情况。 我们以含人masp1、masp2全长编码区cdna的pgem-masp1、pgem-masp2质粒为模板，设计引物，扩增出入masp1和 masp2的c端基因片段，将其分别克隆至pet-17b质粒中，经pcr及基因测序鉴定序列正确后，导入大肠杆菌bl21(de3)，在氨苄青霉素抗性 的筛选培养基上获得了表达目的基因的pet17b-masp1c和pet17b-masp2c重组大肠杆菌，以iptg诱导其表达masp1- c/his、masp2-c/his融合蛋白，经sds-page鉴定证明融合蛋白存在于包涵体中。构建共表达o型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,fmdv) 衣壳蛋白前体p12a和蛋白酶3c的重组杆状病毒,为进一步研究fmdv 空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础.从质粒t-op1中扩增出编码o型fmdv衣壳蛋白前体的p12a 基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pfastdual-3c的ph启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pd-p12a3c.通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒b-p12a3c,转染sf9细胞,获得表达o型fmdv衣壳蛋白的重组杆状病毒.重组杆状病毒经增殖并感染sf9细胞后,通过双抗体夹心elisa方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表达.结果表明,表达产物能被o型fmdv阳性血清识别,具有一定的反应原性,表明重组杆状病毒构建成功,该研究为o型fmdv空衣壳的体外组装及基因工程亚单位疫苗的研究提供了前期材料.。

技术实现要素：

通过对于全转录组数据的分析，发明人发现Tmem173基因可编码除了在细胞内质网上的传统型STING(STING亚型1)之外，还可以编码表达在细胞表面的其他STING亚型(发明人命名为人STING亚型M和小鼠STING亚型M，以下统称STING亚型M)。通过5’RACE的方法，发明人确认了STING亚型M在人和小鼠体内以及广泛肿瘤细胞系中的存在。体外研究发现，这些STING亚型M可以直接感受细胞外的环二核苷酸从而作为细胞外环二核苷酸的受体。细胞外的环二核苷酸可以激活STING亚型M从而激活下游的一型干扰素的启动子进而促使一型干扰素的表达上调。核苷酸合成抑制剂因此，作为外源性的环二核苷酸的受体，STING亚型M是疫苗开发以及肿瘤免疫治疗的重要药物靶点。

发明人发现Tmem173基因编码的STING亚型M位于细胞膜上以及内质网中，小鼠STING亚型M氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，人的STING亚型M氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

另一方面，本发明提供一种用于表达STING亚型M的重组载体，例如可以是pCMV6-Entry，其含有上述的DNA序列。

3`外切酶活性，一般试剂厂家只给taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给taq酶5`&mdash。例如，有用的标记包括32p、荧光染料、电子密度试剂、酶(例如在elisa中常用的酶)、生物素、地高辛、制成可检测形式的(例如通过将放射性标记混入肽)半抗原和蛋白、或用来检测与肽特异性反应的抗体的半抗原和蛋白。生化试剂：抗生素、维生素、培养基、染色剂、酶/辅酶、碳水化合物、分离试剂、缓冲试剂、核酸及衍生物、氨基酸/蛋白质等其它生化试剂，我们提供各产品名称品牌。

本发明中的试剂盒包括分别装有RNA提取试剂，RT-PCR扩增反应液，混合酶，阴性质控品，阳性质控品，STING亚型1和M mRNA阳性标准品的加盖密封的多个试剂瓶或管，和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中，所述混合酶包含Taq DNA聚合酶和逆转录酶(RT酶)；所述RT-PCR扩增反应液包含有以下寡核苷酸引物或与下述序列同源性大于85％的序列或使用下述所有序列中的任意一种或一种以上的组合：

固定化酶易于与产品分离，由于反应体系中只有底物，产物，固定化酶，反应结束后将固定化酶从反应体系中分离回收，体系中只存在产物，易于进行产品的精制，产品纯度高。建立一种利用荧光定量pcr扩增反应进行单核苷酸多态性(snp)快速测定的方法.以人β肾上腺素受体2基因中的arg16gly为研究对象,利用荧光染料sybrgreenⅠ标记定量pcr产物,通过pcr生长曲线和融解曲线分析结果进行snp分型.为提高snp测定的特异性,分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物3′端倒数第3个碱基位置,引入了一个人为错配碱基,使引物的错误延伸率显著降低,大大提高了snp分析的准确性.通过dna测序验证荧光定量pcr对β肾上腺素受体2基因中arg16gly分型结果的准确率.实验结果表明,所建立的方法操作简便,结果准确,适合进行大规模样品的snp检测工作.。在酶溶解液中加入0.2% (w/v)碳二亚胺以及0.2% (w/v)n-羟基琥珀酰亚胺，8°c下反应60min，将氨基化载体分散于酶液中，30°c在搅拌转速200rpm下反应2h，在反应液中加入2倍反应液体积的丙酮和0.5% (v/v)戊二醛，继续反应lh。

本发明还提供了一种能特异性鉴别以及测量STING亚型1和M蛋白含量的方法和试剂盒。本试剂盒检测的基本原理是蛋白质印记技术实现分别快速、高效、特异、定量检测STING亚型1和M蛋白表达水平检测的目的。

本发明中的试剂盒包括样品处理所需的溶液，蛋白质印记技术所需的预制胶，转膜所需要的PVDF膜，抗STING亚型1和M的抗体，二抗，STING亚型1和M蛋白阳性标准品，以及显色所需的试剂。优选的，通过使用试剂盒所提供的样品处理溶液来处理样品并进行蛋白印记实验，通过目标蛋白的条带(图2)以及STING亚型1和M标准品的对比可对STING亚型1和M蛋白表达水平进行半定量计算。

所以建议使用逆转录(包括慢病毒)载体获得单拷贝细胞稳定株。多价疫苗是包含同一种细菌或病毒的不同亚型或血清型的疫苗。2.3.4 体外释放 共聚物胶束的体外释放机制有3种：共聚物载体的溶蚀、从载体孔道扩散、从载体表面释放。

1.是唯一可以进行长期研究的方法.双链rna只能短暂抑制哺乳动物细胞的基因表达,而具有发卡结构的双链rna能够增加阻断基因表达的时间.在小鼠畸胎瘤细胞,胚胎干细胞,c2c12细胞中,用长链具有发卡结构的双链rna有效的阻断了报告基因的表达,在稳定表达具有发卡结构的双链rna的细胞株中,报告基因的表达被长期的阻断了.带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久.即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选,也有助于富集带质粒的细胞.这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题.。可以使用的采用本发明的一种或多种t1r的测定以举例的方式包括利用对活细胞进行遗传选择的测定、利用全细胞或膜片段或经纯化t1r蛋白的测定、利用诸如camp和ip3等第二信使的测定方法、检测将抑制蛋白转运到细胞表面的测定、通过检验配体来检测细胞表面上受体表达的缺失(内在化作用)的测定、直接配体结合测定、用抑制剂进行的竞争结合测定、用体外翻译蛋白进行的测定、检测配体结合后构象变化的测定(例如，如通过蛋白水解、荧光或nmr证明)、利用表达t1r或t1r组合的转基因非人类动物(例如蝇类、蠕虫或小鼠)的行为测定和利用由含有t1r基因的重组病毒感染的细胞的测定。与之相似的是，同样能够激活 rig-i 信号通路的另一种病毒新城疫病 毒，它在 aip4 基因缺失的细胞中的扩增也受到了很强的抑制，这是因为相较于 野生型的细胞和恢复了人源的 aip4 的细胞， aip4 基因缺失的细胞能够产生更多 的一型干扰素来抑制病毒的扩增（图 3-12h）。

本发明中的试剂盒包括稳定表达STING亚型M的细胞系，优选的，所述细胞系还包含报告基因，用于指示STING亚型M被激活或被抑制，更加优选的，所述报告基因位于一型干扰素或NF kappB反应原件启动子下游。优选的，试剂盒还可以包括报告基因所作用的底物，以及细胞裂解液。优选的，通过使用图4中所描述的利用本试剂盒筛选方法，可以达到高效筛选STING亚型M的激活剂以及抑制剂的目的。

可见，本发明首次发现了STING亚型M是感受细胞外环二核苷酸的受体，并实现其在真核细胞中的稳定表达。因为细胞外环二核苷酸在肿瘤免疫治疗以及疫苗开发中显示了良好的效果，证明了细胞外环二核苷酸的受体，也即发明所描述的STING亚型M，是肿瘤免疫治疗的重要靶点。针对细胞外环二核苷酸的受体(STING亚型M)进行进一步的药物筛选开发和优化对于促进疫苗开发及肿瘤免疫治疗的发展有重要作用。另外，这个受体本身表达的水平也将会是对于利用细胞外环二核苷酸以及其他STING激动剂来进行治疗的重要药敏性标志物。本发明所提供的特异性鉴别以及测量STING亚型M的mRNA以及蛋白水平的方法及试剂盒将会对这个靶标的检测起到重要作用。利用本发明进行高通量小分子药物和抗体药物的筛选能够有力的推动基于STING亚型M的疫苗开发和肿瘤免疫治疗的发展。

到目前为止，STING的激活剂只有有限的几个自然界存在的环二核苷酸，另外，而其抑制剂并没有被发现。本发明为发现STING的激活剂及抑制剂提供了一个新颖、高效、可靠、简便的平台，适于高通量药物筛选，对于寻找环二核苷酸的受体的激活剂及抑制剂具有重要意义。

附图说明

图1显示从小鼠脑组织和脾淋巴细胞中以及人的Hela细胞和外周血单个核细胞(PBMCs)对于STING亚型M特异性片段进行RT-PCR的电泳结果，其中泳道1为100bp Marker，上图中泳道2和3分别为在脑组织和脾淋巴细胞中对于小鼠STING亚型1和M进行RT-PCR的电泳结果。桑格尔测序证明所示条带分别为STING亚型1和M。下图中泳道2和3分别为在Hela细胞和PBMCs中对于人的STING亚型1和M进行RT-PCR的电泳结果。桑格尔测序证明所示条带分别为STING亚型1和M。