乳腺生物反应器_膜生物反应器原理_一次性生物反应器(12)

2、基因打靶与体细胞克隆结合是乳腺生物反应器的发展趋势

2.1 基因打靶实现目的基因的定点整合

利用同源重组原理的基因打靶技术，能够将目的基因定位整合于乳蛋白(或其他合适的)基因座，充分利用天然乳蛋白固有的高效表达调控机制，克服拷贝数依赖性和随机整合的位置效应，保证目的基因在乳腺中的特异性表达，并可能取得与乳蛋白一致的表达水平。基因打靶的前提是构建合理的打靶载体，通常的打靶载体分为插入型载体和置换性载体，区别在于载体与靶基因组同源序列双链断裂位点的位置不同；20世纪90年代又出现了“Hit and Run”和“Tag and Exchange”两种新的打靶策略。但无论是哪种方法，其所依赖的同源重组是一个稀有事件，其在胚胎干细胞中发生的频率比体细胞中高3000倍，而小鼠基因打靶之所以应用较广泛，也是因为其胚胎干细胞建系及胚胎重建技术较为完善。目前大家畜的胚胎干细胞建系进展缓慢，以其进行基因打靶制作乳腺生物反应器还无法实现。另外，以上4种打靶策略均为完全基因敲除，导入的外源筛选基因片断可能会对内源性调控造成致命干扰，从而影响基因DNA功能的变化，在胚胎发育的早期就将靶基因敲除置换，亦无法反映出基因受到的特定调控作用。

2.2 条件性重组体系与核移植技术的巧妙结合

条件性同源重组技术中，独特的DNA序列可在重组酶的作用下发生高效重组，从而将打靶事件限定在特定的细胞形态和特定的生命周期，实现时空双向的调节。常用的2种条件性重组体系是CreLoxP系统和FLPfrt系统，基本原理是在Cre或FLP重组酶作用下，相应地敲除靶基因LoxP位点或frt位点间特定的DNA片断；当在靶染色体上引入LoxP位点或frt位点后，含有相应序列的构件在重组酶Cre或FLP作用下插入靶位点，即实现了基因的条件性定点整合。

由以上讨论可以想象，以条件性重组体系对大家畜体细胞进行打靶，将目的基因整合到合适的基因座后，通过体细胞核移植技术生产转基因动物，将是一种很巧妙的方法。首先，条件性基因打靶可以保证目的基因在乳腺的特异性高效表达，并且可以进行激素、调节因子的诱导性生产，通过筛选培养，可100%保证供核细胞对目的基因的整合。其次，从现有成果看，体细胞克隆技术生产转基因动物的成功率已经超过了显微注射等常规技术，并且克隆技术可以缩短生产周期，并可以选择性克隆雌性细胞。两项技术的结合，基本突破了动物转基因技术的发展屏障而又具有明显的生产优势，是未来动物乳腺反应器发展的必然趋势。2000年，英国PPL公司将人AAT基因定点整合到胎儿成纤维细胞的α1原胶原(Procollagen)基因座位，而后用转基因细胞进行核移植，生产出世界首例基因打靶绵羊，其乳中AAT蛋白含量达到了650mg/L，远高于显微注射法18mg/L的水平；据《Science》2002年2月报道，赖良学等用核移植方法获得了4头敲除了α-1，3-半乳糖苷酶基因的克隆猪。这两项最近的研究成果虽然并不完全采用“条件打靶-体细胞克隆”方法，但都是以体细胞核移植技术为支持平台，通过基因打靶(敲除)于细胞水平上操作处理的结果，其成功经验预示着这项技术的良好发展前景。

各种抑制内源基因表达策略如三级螺旋法、反义RNA法(RNA干涉法)和翻译抑制蛋白法的出现，在某些层次上也为乳腺生物反应器的研究提供了思路。这些方法只要转入一个抑制基因(或一段抑制核酸序列)，即可以特异性、精确而灵活地抑制某种内源基因的表达，但方法体系还远未成熟到应用于大家畜转基因技术的程度，而只是比较有发展潜质的基因治疗技术。

3、问题及展望

目前，生产实践中动物乳腺生物反应器的应用已崭露头角，但这项技术还存在着众多问题，首先是研发周期长、前期投资大及技术难度高等，导致所有产品都未商品化；其次，有关转基因动物的基础理论研究还比较薄弱；另外，乳腺生物反应器的异位表达和表达产物的泄露问题也需要各种新技术来解决；最后，人们出于对转基因产品安全性以及转基因技术所涉及的伦理道德问题的考虑，对转基因产品接受程度不高，这在一定程度上阻碍了乳腺生物反应器的发展。

乳腺生物反应器这项技术还需要在众多方面加以改进，尤其是转基因动物生产效率低和基因表达受“位置效应”影响这两大技术瓶颈。虽然核移植与基因打靶技术相结合可消除转基因技术的发展屏障，但这两项高新技术还未完全成熟，尚存在着许多缺陷。然而，成功的实例证明，这两项技术正在不断完善和完美对接，最终将会为乳腺生物反应器的商品化铺平道路，并造福于人类。上传有关于动物乳腺生物反应器的文章：

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