乳腺生物反应器_膜生物反应器原理_一次性生物反应器(11)

以乳蛋白调控区构建的普通质粒表达载体属于基础性表达载体，机械地将调控元件与外源基因组装在一起，人工雕琢痕迹很重，尽管偶尔可获得较高水平的表达，但绝大多数表达水平只能达到微克或毫克级。在表达载体上引入鸡溶菌酶等基因的MAR或与之共注射，可从某种程度上消除位置依赖性，但是这种方法只是将表达构件“绝缘”在染色体的独立区域，并未达到定点整合的结果。整体上看，这类质粒载体制作出乳腺生物反应器的效率很低，基本无法形成商品化的规模。近几年来，酵母人工染色体(YAC)技术得到了较大发展，其可将目的基因替换成乳蛋白基因的独立转录单位，而后将乳蛋白整个区域组装成YAC并转染ES细胞，或直接注入受精卵的原核去制作转基因动物。YAC法可保证表达调控序列的天然状态，克服了质粒表达载体存在位置效应这一最致命的弱点。Fujiwara等以人生长激素基因替代人。乳白蛋白的结构基因部分，以之构建成YAC表达载体，制作出转基因大鼠，乳腺中高效表达了人生长激素(0.25-8.9mg/mL)。尽管YAC法中基因的表达保持了精确的时空性，但现在还没有成功使用YAC法制作转基因大家畜的例子，且整个技术体系还不成熟，仍需改进和完善。

1.1.2 目的基因

1.2 基因转移技术

1.2.1 显微注射法

此法由Gordon等于1980年建立，即将表达载体(线状或环化)直接注射到受精卵原核内部。通过此法已经产生了转基因小鼠、兔、猪、绵羊、山羊和奶牛，但是转基因效率也是逐次降低，奶牛的效率更是低到了0.5%以下。这是由于奶牛繁殖率低，尽管超排可以获得较多胚胎，但是卵母细胞的体外成熟和体外受精以及早期胚胎的体外培养技术仍未达到令人满意的程度；并且大动物胚胎胞浆含有大量泡状颗粒，影响透光性，不易显微操作。实践证明，此法对大马哈鱼和另外一些鱼类十分有效(并不是全部)，而对于大家畜还需要建立更多的转基因系以供传代和研究，以期找到提高效率的合适策略。

1.2.2 配子介导法

使用较多的是载体技术，即将(或头)和目的基因共孵育后，进行体内或体外受精。采用此法需提高质膜通透性，因此要采用电激、冷冻，甚至是去污剂处理，但质膜易被破坏而导致大量失活，而且插入的目的DNA也会发生降解，因此这种方法的效率并不比传统的显微注射高，试验结果也很不一致。处于MⅡ期的卵母细胞核膜会发生分解，出现一个短暂的核膜分解期，这为外源基因的整合提供了可能。目前，采用将目的基因转染的或整合的逆转录病毒注射到MⅡ期卵母细胞质的方法，已经制作出转基因小鼠、猴和牛，用这种方法整合的目的基因不但有序稳定，而且拷贝数和插入位点相对固定，产生后代的纯合个体多。尤其是后一种方法，是能反复转导外源基因到鸡体内的唯一方法，但其携带外源基因能力较差，并且病毒颗粒LTR与基因启动子之间可能存在互扰。

1.2.3 核移植介导法

1997年底，英国Roslin研究所和PPL公司通过克隆转基因体细胞，获得了6只整合neo或neo和F-Ⅸ基因绵羊，这标志着核移植介导的转基因技术成功问世。理论上讲，外源基因转染的细胞在体外筛选培养后，通过核移植技术生产的转基因动物100%为阳性个体，但实际上生产效率大约只有2.5%。成年动物体细胞经过长期体外培养，会出现染色体丢失、异常甲基化等现象，用作核移植时效率很差，用此法获得成功的例子均使用了胎儿成纤维细胞为供核细胞，以最大限度地克服这一缺陷。显然，成熟的供核细胞培养技术对此法来说十分关键，若想获得普遍成功，就必须将细胞培养技术改善得更为合理成熟。另外，对一些高繁殖的动物来说(小鼠、兔、猪)，显微注射法仍保持着优越性。