乳腺生物反应器_膜生物反应器原理_一次性生物反应器(10)

当前工作

我们课题组最近一年来的工作重点是将大动物的转基因技术与体细胞核移植技术结合起来，对经济大动物做特定的遗传改造：在细胞水平上进行转基因或定位基因置换，然后将遗传改造过的细胞通过细胞核移植来产生转基因的克隆动物。目前我们在研工作有：

1.山羊b酪蛋白基因座插入人（EPO）基因的同源取代的打靶构件。希望将人的基因整合到（knockin）山羊b酪蛋白基因座上来表达人。目前此打靶构件已经完成，在进行山羊胎儿成纤维细胞转染和打靶克隆细胞系的筛选和鉴定。

2.牛as1酪蛋白基因座插入蜘蛛丝心基因、插入loxP-neo-loxP框架的同源取代的打靶构件。蜘蛛丝作为一种新材料无论在日常生活还是在军事领域都有极大的应用前景。前者目的在于将蜘蛛丝心基因取代牛内源的as1酪蛋白基因，得到蜘蛛丝心蛋白高表达；后者是一种通用的框架，在打靶成功后，可用任何要表达的目的基因通过位置特异的重组酶取代neo基因。

3.人乳白蛋白和乳铁蛋白的同源整合构件。这类蛋白极富营养又兼具其他生物活性（如抗癌，抑菌等），高表达奶样即可直接用于营养品以缩短成果转化的时间，又可从中提取目的蛋白用于医药。以此改良的乳汁将有极大的市场潜力和产品竞争力。

人的a＋b珠蛋白基因取代猪b珠蛋白基因的构件，这是猪血红蛋白人源化的第一步，我们已经有了人的a＋b珠蛋白基因组结构基因，目前正在从猪的基因组文库钓取b珠蛋白基因座的有关序列。乳腺生物反应器希望在年内构建成打靶构件。动物乳腺生物反应器研究进展

乳腺生物反应器是转基因动物技术的重要分支，核心内容是利用乳蛋白基因的乳腺特异性调控成分驱动外源基因在动物乳腺中的高效表达，以期从乳汁中源源不断地获得大量外源蛋白。从目前的研究成果看，与传统的原核系统及细胞发酵系统相比，动物乳腺生产的重组蛋白产品具有以下特点：(1)生物活性高，无污染。动物乳腺作为一个完善的“分子农场”，可对重组蛋白进行完全的翻译后加工，包括糖基化、磷酸化和羧基化等，从而保证产品的高生物活性，并且不易产生抗药性。(2)纯化简单。现已建立了完整的分离和纯化乳中重组蛋白的生产程序，用常规方法除去酪蛋白后将乳清分级沉淀，再用常规的层析技术即可分离纯化。(3)产量高，成本低。外源基因在动物乳腺的表达量可达每升几克到几十克，小群转基因大家畜的产量即可满足全世界市场的需求。一旦获得有高量表达的祖代个体，其遗传性即可保证维持生产的低成本。总之，动物乳腺生物反应器已成为生物技术领域发展的尖端方向，具有广阔的开发前景。针对这一现状，本研究对其研究进展进行了综述，以期为动物乳腺生物反应器的深入研究提供资料。

1、动物乳腺生物反应器的研究现状

1.1 表达载体的构建

1.1.1 调控序列

制备乳腺生物反应器的关键是保证目的蛋白特异性在乳腺中的高效表达，传统表达载体都是选用某种乳蛋白基因的调控序列作为启动子元件。目前，已经克隆并用作构建载体的乳蛋白基因主要有β-乳球蛋白(BLG)基因、αSl-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳清酸蛋白(WAP)以及乳清白蛋白基因。后2种基因的调控区虽可以指导外源基因表达，但乳腺表达的特异性及效率均不及前3种。这些基因的调控区主要包括启动子区、增强子序列和其他众多转录、翻译相关元件。实际使用中，反刍动物一般采用同一物种的启动子，并以BLG使用较多；家兔、猪和鼠类则采用WAP。另外，乳蛋白基因调控序列可以混用，比如用αSl-酪蛋白5′调控区与β-酪蛋白3′端调控元件仍可以构建有效的表达载体。而且大量研究发现，增加乳蛋白基因5′端调控区的长度及使用其第一、第二内含子，往往可获得高效表达的机会，这可能是由于5′远端及内含子中含有增强子或顺式作用元件，甚至是含有可对抗位置效应的位点控制区(LCR)或基质结合区(MAR)。