酚、氯仿、异戊醇法沉淀DNA

酚：氯仿：异戊醇法抽提基因组DNA

1.从无水乙醇中取出少许肌肉或者性腺组织（约50mg），剪碎，加入干净灭菌的EP管中；

步骤iv得到的检测液中在37°c下培养15分钟，将胰蛋白酶溶解于浓度为10 mm, ph8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，在检测液中分别加入相同体积不同浓度的胰蛋白酶，以加入缓冲溶液作为空白对照，浓度范围从0. 01到100呢ml—1，在37°c下进行荧光光谱跟踪检测，以荧光发射峰强度下降的比率对时间作图，得到不同浓度胰蛋白酶催化水解条件下荧光发射峰强度线性下降的时间范围。步骤iv得到的检测液在35 37°c下培养10 15分钟，将胰蛋白酶溶解于浓度为10 mm,ph 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，在检测液中分别加入相同体积的胰蛋白酶缓冲溶液，以只加入缓冲溶液作为空白对照，胰蛋白酶终浓度范围为0.0广100 ml—1，在35 37°c下进行荧光光谱跟踪检测，以荧光发射峰强度下降的比率对时间作图，得到不同浓度胰蛋白酶催化水解条件下荧光发射峰强度线性下降的时间范围。配制细胞裂解液（现用现配）： 将裂解缓冲液和抑制剂溶液等体积混合，然后加入dtt溶液，使其浓度为1 mm。

SNET：

20mmol/L tris-Cl (Ph8.0)

5mmol/L EDTA (Ph8.0)

400 mmol/L NaCl

1%(m/V) SDS

上述溶液需经过0.45μm的硝酸纤维素滤器过滤除菌，保存于室温。

3.管子垂直放置于震荡平台或振动恒温箱中55℃放置过夜（消化过程中样品的充分混合时非常必要的。过夜消化后，应当看不到组织，缓冲液呈现灰色状态）.

4.加入等体积(600μL)的酚：氯仿：异戊醇，密闭管口，室温下置于震荡平台30min.(不同的实验阶段，需要不同的振动速度.)

备注：酚取下层（上层为保护液）过会变成淡黄色为佳，酚：氯仿：异戊醇混合后澄清才可以用

5.离心吸取上清（4℃ 11,000 rpm（11200×g）最大转速简短离心25分钟（5min钟就好），转移上清至另一新的离心管中）。

快检卡：猪肉方面，目前使用胶体金试纸，只需要取一些猪肉样品，放在离心管中，在水浴中煮10分钟，将煮出的汁液加同样体积的配套缓冲液氯仿异戊醇抽提，混匀氯仿异戊醇抽提，用于检测即可，几个ppb（μg/kg，ng/g）的瘦肉精就能被测出。2．3．2接种前细胞的准备 a375细胞传代至对数生长期后收集所需细胞数瓶，pbs液清洗2次，经胰酶消化至细胞大部分变圆，倒掉消化液，加入高糖dmem培养液，1000转离心5rain，加入4mlpbs液重悬浮细胞后如上条件再离心一次。说明: centriprep ym-3，3 kda nmwl商标名: centriprep数量/包装: 24操作注意: 甩平转子，最大离心力为 3,000 x g滤膜材质: 再生纤维素离心作用: protein concentration and desalting色码: 黄色滤膜商标名: ultracel最小浓缩终止体积，µl: 700滤膜类型: 超滤膜长度，mm: 135nmwl，kda: 3残留体积，µl: 500直径，mm: 28.1滤膜代码: ym-3体积，ml: 15密封材质: 聚丙烯产品名称: 装有 ultracel-3 超滤膜的 centriprep 离心超滤管过滤面积，cm2: 2.84装置材质: 样品存储槽和滤过液收集器：聚碳酸酯 旋转锁定盖：尼龙 订购说明: centriprep ym-3 3kda 24片/包装。

7.重复酚/氯仿/异戊醇抽提过程2次后，然后换成每管600 uL 氯仿抽提。

8.回收的上清液等体积异丙醇，温和混匀后-20℃静置2 h

9.4℃13000转/分离心20min，弃上清； 5min

10.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上清；轻柔晃匀

2.2.3.2 测定方法 酶解法降解adrhasms溶液，取阿霉素白蛋白微球混悬液加入酶解介质(内含0.1%胰蛋白酶的ph 7.4磷酸盐缓冲液),于37℃恒温水浴中温育，经裸眼观察混悬液完全转变为透明溶液，由显微镜验证所有微球完全消失，降解液过滤，取40 μl进样，记录高效液相色谱仪测得的峰面积，带入回归方程得到阿霉素浓度。 2．溶液的配制步骤：①计算②称量③溶解④冷却⑤移液⑥洗涤⑦定容⑧摇匀 n3．误差分析：误差分析的理论依据：根据cb＝可得，一定物质的量浓度溶。四、重组蛋白二次变性纯化取第一次纯化的沉淀物用尿素缓冲液(12)(6-8mol/l尿素，1mmol/l edta，100mmol/2-me，20mmol/l naac(醋酸钠)，ph3.5-7.0)变性溶解，于4℃离心12000rpm×20min，离心弃不溶物，留上清液调整蛋白浓度为8-10mg/克备用。