分子克隆常用载体质粒和噬菌体

35.黏端质粒或粘粒:一个将λcos位点插入质粒的克隆载体，用于克隆超过40kb的dna片段。在dna重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。为了获得克隆的基因或核酸(例如编码本发明的t1r、片段或变体的cdna)的高水平表达，本领域技术人员通常将所述感兴趣的核酸序列亚克隆到表达载体中，所述表达载体包含指导转录的强启动子、转录/翻译终止子，如果所述核酸是编码蛋白的核酸，所述表达载体包含用于翻译起始的核糖体结合位点。

1.2.1 酵母双杂交载体的构建: 利用pcr扩增的方法从成人肝cdna文库中获得hpo205和cytc编码基因的dna序列, 通过相应限制性内切酶酶切后, 与同样酶切后的含dna结合结构域(dna binding domain, db)的pdbleu空载体和含转录激活结构域(activation domain, ad)的ppc86空载体连接, 连接产物转化e.coli. jm109感受态, 相应抗性筛选(pdbleu: 卡那抗性。3、用限制性内切酶bstbi和kpni双酶切pgagz a a载体，回收约3.1kb的载体骨架。3、用限制性内切酶ecori和kpni双酶切ppink_lc载体，回收约7.7kb的载体骨架。

以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用性。

为了便于获得阳隆克隆 ，载体上常有筛选标记，如对抗菌素的抗性，某些基因产物的显色反应等。

一、质粒

常用的有pBR322，pUC系列质粒等。

(一)pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA 载体，有2个抗药性基因(四环素和氨苄青霉素)，一个复制起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。

三是抗药性问题，作为转基因食品的标记基因的抗生素抗性基因，可能被转入人体消化系统的细菌体内，使其对抗生素药物的治疗产生抗性。所谓超级细菌，就是那些生长繁殖不受特定抗生素抑制的特殊细菌，这些细菌中要么含有某种抗生素抗性基因编码质粒，如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌（mrsa）的ndm-1以及碳青霉烯...点击阅读全文，收听完整ta说内容。据已测序的上西早生柿etr5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,pcr扩增到2个etr5-uenishiwase基因片段.2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断.连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体psmak321的35s启动子和nos终止子之间,构建成uenishiwase-etr5基因的rna干扰植物表达载体.载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌eha101中.以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200 μmol/l的as及spc梯度筛选能有效提高转化率.转化植株经pcr检测得到7株阳性植株.。

(二)pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA 质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆 位点，多克隆 位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株(M15)时，因为由质粒表达的α-肽补充了大肠杆菌却失的α-肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆 。

如果在多克隆 位点内插入外源DNA ，由于它破坏了α-肽的表达，因而在加入IPTG和X-gal的培养基，不能长出蓝色克隆 ，这就是所谓的蓝白筛选。

二、单链丝状噬菌体和噬粒

(一)大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体f噬菌体等，其基因组均是单链闭环DNA 分子，其中M13mp系列克隆 载体是对野生型M13加以改造，插入了多克隆 位点和LacZ基因后的载体，所以也是可以利用IPTG和X-gal作蓝白筛选的，M13感染大肠杆菌后，即在菌体内酶的作用下，以感染性单链DNA (正链)为模板，转变为双链DNA ，称作复制型DNA (RF DNA )。

一般当每一个细胞内有100-200个RF DNA 拷贝时，即停止复制，产生有感染性的完整的单链丝状噬菌体并分泌离开菌体。感染M13的大肠杆菌可继续生长，并不发生裂解，但生长速度则较正常菌慢，取感染M13的细菌培养液离心，即可从菌体中提取RF DNA质粒和载体，供限制酶切割等分子克隆 操作之用;从离心后的上清液中，可用聚乙二醇(PEG)沉出噬菌体颗粒，提取单链DNA (ss DNA )供DNA 序列分析，体外定位突变等使用。

(二)噬粒(phagemid)在质粒DNA 中插入一段单链噬菌体的复制起始点DNA ，即构成了噬粒，如pGEM-3Zf(-)就是一种噬粒。噬粒可像一般质粒一样操作，但当需要制备单链DNA 时，就需要在培养时加入辅助噬菌体质粒和载体，常用的辅助噬菌体有M13KO7和R408。

旨在为研究猪t细胞受体分子结构与功能,并首次在国内克隆了猪t细胞受体α链基因.以genbank上登载的猪t细胞受体(t cell receptor,tcr)α链(ab087988)为参考序列,从甘肃合作猪外周血液淋巴细胞中用rt-pcr的方法克隆了tcr-α链基因(ptcr-α).结果表明:克隆的tcr-α基因具有完整的orf,全长819 bp,编码272个氨基酸,预测蛋白分子量为30 kda,含18个强碱性氨基酸,23个强酸性氨基酸,87个疏水性氨基酸和103个极性氨基酸,含有一段20个氨基酸的信号肽序列。还可以把沉淀的dna克隆到载体中，进行测序，寻找该序列附近的开放阅读框，发现新的基因调节序列。如果要用载体的元件就把自己序列的启动子终止子去掉，如果要用自己的启动子终止子，就把自己的序列插入到载体的多克隆位点去，不用载体的元件。