一种重组质粒载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组质粒载体及其构建方法和应用。

背景技术

RNA干扰(RNAinterfering，RNAi)是指双链RNA进入细胞后诱导靶基因mRNA发生特异性降解，导致目标基因mRNA沉默的现象，是生物长期进化过程中形成的对病毒等外源物质的防御系统。长度为21-23nt的siRNA能够引发RNAi，可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，并具备高效性、易合成及易操作的特点，所以该技术已被广泛用于基因功能探索和基因治疗领域。

若想用基因工程并通过土壤农杆菌向某种植物中导入抗旱基因，以下分析不合理的是()a．若用ti质粒作为抗旱基因的载体，要保证复制原点和用于转移t－dna的基因片段不被破坏b．农杆菌转化法自然条件下用于将目的基因导入双子叶植物和裸子植物c．用含有重组ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，可以通过植物组织培养技术培育出具有抗旱基因的植物d．若能够在植物细胞中检测到抗旱目的基因，则说明该基因工程项目获得成功18．北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。str（short tandem repeat，短串联重复序列）广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性，它们一般由2～6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。重组质粒ppgh-hxo i中还包括序列表的序列7所示的ade2启动子、序列表的序列8所示的ade2基因(报告基因)、序列表的序列9所示的trp2基因(色氨酸合成酶基因)、序列表的序列10所示的amp抗性基因(氨苄青霉素抗性基因)和puc复制起点。

体外筛选最常用的方法是利用表达目的基因的细胞株，将siRNA转染到细胞中，之后通过定量聚合酶链式反应(qPCR)或是蛋白质免疫杂交(WesternBlot)等方法，定量检测目的基因的表达变化来评价siRNA的作用效果。这一方法的缺点是，针对不同的目的基因研究需要选择不同的细胞株，对于有些基因，没有表达该基因的细胞株，还需要通过转基因或是诱导等方法建立，操作繁琐、费时、成功率低；并且，在定量检测的过程中，需要提取总RNA或总蛋白质，再进行qPCR或WesternBlot进行定量，整个过程步骤多，不仅费时还容易引起误差。

回答下列问题： （1）用基因工程方法制备 hiv 的某蛋白（目的蛋白）时，可先提取 hiv 中的________，以 其作为模板，在___________的作用下合成___________，获取该目的蛋白的基因，构建重组 表达载体，随后导入受体细胞。测序报告还显示有3个突变，分别位于megalin基因的3404、3647、3702，其中前两个突变都不影响融合蛋白的氨基酸序列，第3个突变则将赖氨酸变成谷氨酸，经分析对融合蛋白表达无明显影响。研究某个蛋白因子的调控功能，可以通过对蛋白活性（激活或抑制其活性），蛋白数量（过表达overexpression或基因缺陷型knockout）, 以及蛋白功能（功能缺陷型蛋白dominant-negative mutation）的控制，影响下游基因的表达，而下游基因的变化又可以通过基因芯片（cdna microarray），抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization），差异显示rt-pcr等方法进行研究[1]。

之后使用荧光素酶基因代替GFP基因作为报告基因，其在具有上述优点的同时，利用在催化底物氧化过程中会发出生物荧光且荧光强度与荧光素酶的量正相关的特点，可以极其灵敏、高效的定量检测出基因表达量的变化，例如现有的siCheck载体。但是，由于基因本底原因，siCheck载体会造成基因表达量变化不明显，从而导致对siRNA筛选分析结果的不准确；而在表达毒性蛋白的基因的siRNA筛选时，毒性蛋白会对细胞造成损伤，导致筛选无法继续进行，因此siCheck载体不能用于过高或过低表达基因以及表达毒性蛋白的基因的siRNA筛选，同时，siCheck载体只能够表达出融合的mRNA，但是不能表达两个基因的融合蛋白(只能表达出荧光素酶蛋白)，因此，该质粒不能用于基因功能研究。

发明内容

采用本发明提供的重组质粒构建重组酵母菌，利用ade2基因与缺陷型受体菌之间的互补特性进行阳性重组子筛选质粒和载体，安全、可靠。第五，另一个需要重点关注和排查的因素就是目的基因的表达载体构建和抽提纯化环节，是否构建时导致质粒载体重组或某个部件缺失，或污染别的质粒或杂物。重组质粒上有标记基因，并不是转入农杆菌才能筛选，而是用农杆菌转化法，有利于重组质粒导入受体细胞。

我们以含人masp1、masp2全长编码区cdna的pgem-masp1、pgem-masp2质粒为模板，设计引物，扩增出入masp1和 masp2的c端基因片段，将其分别克隆至pet-17b质粒中，经pcr及基因测序鉴定序列正确后，导入大肠杆菌bl21(de3)，在氨苄青霉素抗性 的筛选培养基上获得了表达目的基因的pet17b-masp1c和pet17b-masp2c重组大肠杆菌，以iptg诱导其表达masp1- c/his、masp2-c/his融合蛋白，经sds-page鉴定证明融合蛋白存在于包涵体中。当需要表达蛋白时通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程，克隆进t-载体，需优化电泳上样体积、质粒抽提及酶切分析。将乙肝病毒表面抗原(hbsag)类主蛋白的编码基因s插入真核细胞表达质粒prc／cmv中cmv启动子的下游，所获得的重组质粒转染真核细胞可高效表达hbsag主蛋白。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

通过对粉虱、小菜蛾高效的球孢白僵菌hfw-05 几丁质酶基因的克隆及序列分析,旨在从分子水平上了解hfw-05 菌株的几丁质酶特性.根据已发表的几丁质酶基因序列(eu828354)设计几丁质酶基因全长引物,扩增 hfwbbchit1 全长基因,与大肠杆菌(escherichia coli)克隆载体 pmd19-t 连接获得含有 hfwbbchit1 全长基因的重组质粒 pmdchit1 并测序.该基因的编码区包括1 047 bp,编码了348个氨基酸,分子量约为36.795 kda,进行同源性比较分析结果表明:其基因序列与球孢白僵菌菌株 ncim1216 几丁质酶基因(eu828354)和球孢白僵菌菌株 bb0062 几丁质酶基因(ay145440)的核苷酸同源性最高,同源性达到98%.氨基酸序列与球孢白僵菌菌株 bb0062 几丁质酶(aan41259)同源性达到99%.。建立一种利用荧光定量pcr扩增反应进行单核苷酸多态性(snp)快速测定的方法.以人β肾上腺素受体2基因中的arg16gly为研究对象,利用荧光染料sybrgreenⅠ标记定量pcr产物,通过pcr生长曲线和融解曲线分析结果进行snp分型.为提高snp测定的特异性,分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物3′端倒数第3个碱基位置,引入了一个人为错配碱基,使引物的错误延伸率显著降低,大大提高了snp分析的准确性.通过dna测序验证荧光定量pcr对β肾上腺素受体2基因中arg16gly分型结果的准确率.实验结果表明,所建立的方法操作简便,结果准确,适合进行大规模样品的snp检测工作.。（4）天津科技大学人才引进启动基金项目“海洋蓝藻脂肪酸合成途径关键酶acc基因的克隆与载体构建”（项目编号**），项目负责人，2006-3-1—2008-3-1。

当诱导物存在时，阻遏蛋白因受诱导物作用而构型发生变化，失去与操纵基因的结合能力，从操纵基因上解脱下来，使rna聚合酶能对结构基因进行转录，进而翻译成酶蛋白。在hcl处理的brdu、edu-click-it、fish等实验中，热变性处理会干扰荧光融合蛋白信号的检测，nano-booster主要用于这种生理表达水平下细胞样本中荧光融合蛋白表达的信号强度弱、荧光融合蛋白的耐光性和量子效率一般达不到超分辨率显微镜要求等生物学实验，可以显著增强荧光信号。一般用弗氏压碎法或超声波处理，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因.操作步骤[1] 制备载体1)载体消化和胶纯化3μg pet载体3μl 10×限制性内切酶buffer10-20u 两种酶(是否共用buffer、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/，在细菌培养基中加入iptg来启动表达。

从1 岁开始到⽼年，⼈体内乳糖分解酶的表达量由mcm6 基因决定，mcm6 基因调节lct 基因的表达。1.是唯一可以进行长期研究的方法.双链rna只能短暂抑制哺乳动物细胞的基因表达,而具有发卡结构的双链rna能够增加阻断基因表达的时间.在小鼠畸胎瘤细胞,胚胎干细胞,c2c12细胞中,用长链具有发卡结构的双链rna有效的阻断了报告基因的表达,在稳定表达具有发卡结构的双链rna的细胞株中,报告基因的表达被长期的阻断了.带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久.即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选,也有助于富集带质粒的细胞.这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题.。早花变异枳lfy 基因的启动子结构及表达调控机制研究 胡春根 华中农业大学。

作为优选，所述诱导型启动子来源于四环素操纵子诱导调控系统、脱皮激素类诱导系统、FK506调控系统、纳巴霉素诱导系统或RU486诱导系统；更优选地，所述诱导型启动子为Tet-responsivePtightpromoter。

作为优选，所述组成型低表达启动子为TK启动子。

作为优选质粒和载体，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有多种限制性内切酶酶切位点的寡核苷酸片段。

所述重组质粒的制备方法具体如下:将用限制性内切酶bglii和bamhi双酶切重组质粒pgagz a a-hsa得到含有所述表达盒乙的片段(约2.skb的片段)插入重组质粒ppink-lc-hsa的bamhi酶切位点，得到所述重组质粒(重组质粒ppgh_hx01)。感谢tree_qd的指导,我再说一下我的实验设计:我是将一个150bp的片段连到一个11kb的载体上,现在载体中连有另一个1kb的片段,我是把这个1kb的片段切下来,连上我150bp的片段(没有现成的空载体).我是通过高保真酶从t载体上扩增,然后回收酶切了的pcr产物。（2）若对符合设计要求的重组质粒a进行酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据表中信息分析若采用bamhi和psti酶切，可得到种dna片段．。

所述重组质粒的制备方法具体如下:将用限制性内切酶bglii和bamhi双酶切重组质粒pgagz a a-hsa得到含有所述表达盒乙的片段(约2.skb的片段)插入重组质粒ppink-lc-hsa的bamhi酶切位点，得到所述重组质粒(重组质粒ppgh_hx01)。感谢tree_qd的指导,我再说一下我的实验设计:我是将一个150bp的片段连到一个11kb的载体上,现在载体中连有另一个1kb的片段,我是把这个1kb的片段切下来,连上我150bp的片段(没有现成的空载体).我是通过高保真酶从t载体上扩增,然后回收酶切了的pcr产物。（2）若对符合设计要求的重组质粒a进行酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据表中信息分析若采用bamhi和psti酶切，可得到种dna片段．。

作为优选，所述多克隆位点双链核苷酸序列如SEQIDNO:1-2所示。

作为优选，还包括抗性标记和polyA，所述polyA分别位于萤火虫荧光素酶基因3’端和海肾荧光素酶基因3’端。更优选地，所述polyA为SV40polyA。

作为优选，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

此外，本发明还提供一种重组质粒载体的构建方法，包括：

提供诱导型启动子、多克隆位点、萤火虫荧光素酶基因、组成型低表达启动子和海肾荧光素酶基因并连接各部件获得重组质粒载体；