纪念人工全合成结晶牛胰岛素50周年

叶蕴华：我国成功合成结晶牛胰岛素的启示和收获

叶蕴华(1936—)，1960年毕业于北京大学化学系(现名为化学与分子工程学院)，后留校从事有机化学教学与研究工作40余年，历任助教、讲师、副教授、教授、博士生导师。获国务院政府特殊津贴。于2000年退休。 退休后至今在北京大学世佳研究中心从事中药现代化的研究。曾为本科生和研究生开设《有机化学》、《多肽化学》、《生物有机化学》等课程。1964 年作为北大科研组成员之一到上海与中科院上海有机化学研究所及上海生物化学研究所合作，从事胰岛素合成的研究，于1965年在国际上首次完成了结晶牛胰岛素的全合成。主要从事生物活性肽的合成及构效关系的研究；形成肽键的含磷缩合试剂的研究；环肽合成方法及环化规律的研究；氨基酸，肽—甾体缀合物的合成与生物活性研究；在非水介质中，蛋白水解酶催化酰胺键形成的研究；人参属植物水溶性化学成分的研究等。取得了多项开创性的研究成果，受到国内外同行的关注。

1、引言

你可以通过使用“合成刺激质”来制作刺激剂，而合成刺激质可以在低等级的无尽任务、低等级间谍和特殊警报中限时获得。跑八百米时，后面的四百米，必须由血糖、血脂肪酸和血氨基酸在有氧状态下，合成新的热能物质atp来提供能量，而血糖由淀粉分解后供应，血脂肪酸由脂肪分解后供应，血氨基酸由蛋白质分解后供应，这整个过程需要氧气，也就是靠氧气燃烧淀粉、脂肪和蛋白质来生产热能物质atp，供应后段运动所需的热量，这后段的运动就是有氧运动。辰叶面膜，是国内首款修护敏感肌 激素脸 辐射肌面膜，用于任何肤质，无论是油性肌肤、敏感性肌肤、干性肌肤、混合型肌肤都可完美敷用，因为它的原液来自天然植物萃取，经过特殊工艺合成，坚持无添加 (激素、抗生素、工业防腐剂、酒精、香精)。

1921年，加拿大外科医生Frederick Grant Banting首次从狗的萎缩胰脏中提取了胰岛素，并将初步纯化的动物胰岛素成功地应用于糖尿病患者。基于该项研究成果，Banting与Macleod获得1923年诺贝尔医学和生理学奖。胰岛素的发现被认为是糖尿病研究史上的里程碑，它激发了各个相关领域科学家的兴趣[1]。

可以使用的采用本发明的一种或多种t1r的测定以举例的方式包括利用对活细胞进行遗传选择的测定、利用全细胞或膜片段或经纯化t1r蛋白的测定、利用诸如camp和ip3等第二信使的测定方法、检测将抑制蛋白转运到细胞表面的测定、通过检验配体来检测细胞表面上受体表达的缺失(内在化作用)的测定、直接配体结合测定、用抑制剂进行的竞争结合测定、用体外翻译蛋白进行的测定、检测配体结合后构象变化的测定(例如，如通过蛋白水解、荧光或nmr证明)、利用表达t1r或t1r组合的转基因非人类动物(例如蝇类、蠕虫或小鼠)的行为测定和利用由含有t1r基因的重组病毒感染的细胞的测定。多元醇类表面活性剂,当缓冲液中存在triton x-100时不能通过测定280nm光吸收来进行蛋白定量.triton x-100可以提高真核细胞细胞膜的通透性.1%-0,尤其是膜蛋白,一般具有乳化,ph6.0-8,稍微发黄的液体：triton x-100是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂）,如igepal co.蛋白酶k在含1% triton x-100的溶液中依然保持活性,中性去垢剂在蛋白提取中应用的较多、平平加类.。当时陈举满怀希望的问草头彪和赤虎会不会炼钢吹玻璃时结晶牛胰岛素 邢其毅，草头彪思考了一阵，扳起爪子数着说电话我会提炼各种氨基酸、生长因子、结晶蛋白、核糖核酸、半『乳』糖苷酶、抗体、干扰素、胰岛素等生物制品，至于怎么提炼钢这种dongxi，我就不会了。

满分：100分)一、选择题(每小题2.5分，共50分)1．20世纪70年代，科学家创立了一种新的生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是()a．定向提取生物体的dna分子b．定向地对dna分子进行人工剪切c．在生物体外对dna分子进行改造d．定向地改造生物的遗传性状2．我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达培育出了抗虫棉。这里需要注意区别的是，dna结构形成的是一维线性信息（核苷酸分子线性编码氨基酸分子），蛋白质结构形成的是多维立体信息（氨基酸分子长链要经过多次立体空间结构折迭才能够构成预期功能的蛋白质），大脑思维细胞的立体空间信息结构则更为复杂。这个~显然是在r基上~因为标准的氨基酸都是一个碳原子上面连一个氢原子,一个氨基一个羧基一个r基（脯氨酸的氨基成环了~）,r基就是所有氨基酸的区别.天冬酰胺,谷氨酰胺,赖氨酸,精氨酸的侧链r基上都有氨基这个甜味肽为什么是二肽要怎么回答呢,我只能告诉你他确实是二肽,也就是我们经常说的阿斯巴甜,由l-天冬酰胺-l-苯丙酰胺甲。

由图1可见，A链含有11种21个氨基酸残基，N-端为Gly，C-端为Asn。A 链的6位和11位上的两个Cys通过二硫键相连成环；B链含有16种30个氨基酸残基，其N-端为Phe，C-端为Ala。A链和B链又通过两对二硫键互相连接成胰岛素分子。

图1 牛胰岛素的一级结构

中国首次(世界首次)合成结晶牛胰岛素: 1965年王应睐组织我国科学家首次合成具有全部生物活力的结晶牛胰岛素。我国第一部目录学著作: 1965年王应睐组织我国科学家首次合成具有全部生物活力的结晶牛胰岛素。 1970年4月24日.6万平方米: 1965年王应睐组织我国科学家首次合成具有全部生物活力的结晶牛胰岛素。

2、敢于向难题挑战

信号分子主要是激素.a为消化酶,是分泌蛋白,在口腔中起作用,不属于信号物质.b为激素,属于信号物质,且化学本质是脂质,能以自由扩散方式进入细胞中,与细胞内受体结合.c为激素,属于信号物质,但化学本质是蛋白质,其受体位于细胞膜外表面,不能进入细胞中.d属于胞内蛋白,主要在线粒体中,催化有氧呼吸,不属于信号分子.另,楼下说。其实，早在50年前，中国科学家率先在世界上完成人工全合成结晶牛胰岛素的工作，就已经在尝试将失去活性的蛋白质（将牛胰岛素拆分成两条多肽链），变回有活性的蛋白（将多肽重新折叠、合成有功能的蛋白质）。南水鱼跃食品在技术上掀起了一场反动，以优质非转基因大豆爲原料，应用生物发酵及生物酶解等技术，将大豆异黄酮、低聚糖、短肽氨基酸等和酵母等微生物中的低分子蛋白、维生素、微量元素等养分物质完满结合，精制成最具自然风味和高养分调味汁。

在我国当时的条件下，靠一个单位来完成这个项目显然是不可能的。1959年3月中国科学院上海生化所派了曹天钦、钮经义、邹承鲁、鲁子贤、王芷涯等5人到北大来探讨与北大共同合成胰岛素的可能性，并做了有关胰岛素的学术报告。北大方面积极响应，同意承担合成A链的研究任务。

(2)为了用蛋白质工程设计速效胰岛素，在已知速效胰岛素氨基酸序列的基础上，推测出的速效胰岛素的________序列，据此可利用________方法合成目的基因。旨在为研究猪t细胞受体分子结构与功能,并首次在国内克隆了猪t细胞受体α链基因.以genbank上登载的猪t细胞受体(t cell receptor,tcr)α链(ab087988)为参考序列,从甘肃合作猪外周血液淋巴细胞中用rt-pcr的方法克隆了tcr-α链基因(ptcr-α).结果表明:克隆的tcr-α基因具有完整的orf,全长819 bp,编码272个氨基酸,预测蛋白分子量为30 kda,含18个强碱性氨基酸,23个强酸性氨基酸,87个疏水性氨基酸和103个极性氨基酸,含有一段20个氨基酸的信号肽序列。来自其它物种的有关t1r家族基因在至少约50个核苷酸长度内，或者在100、200、500或500个以上的核苷酸长度的区域内与本文实施例中公开的t1r核酸序列或者其保守性修饰的变体具有至少约50％，或者60％、70％、80％或90％的核苷酸序列一致性，或者所编码的多肽在至少约25个氨基酸长度内，或者在50～100个氨基酸长度的氨基酸区域内与本文实施例中公开的t1r多肽序列或者其保守性修饰的变体具有至少约35～50％，或者60％、70％、80％或90％的氨基酸序列一致性。

关于胰岛素分子中三对二硫键如何能正确配对的问题在立项时就困扰着大家。为了解决这个问题，1959年初上海生化所邹承鲁课题组的杜雨苍、张友尚等开始探索天然胰岛素拆分与重组合的研究。他们的拆、合研究经历了多次失败后，于1959年3月取得了好的苗头，发现重新氧化拆开后的胰岛素A、B链的混合物能表现出天然胰岛素0.7%~1% 的活力。经过进一步探索，拆分和重组合后的胰岛素生物活力可以达到天然胰岛素的5%~10%。他们最终发现，在适当条件下氧化被还原的A链和B链，生物活力的恢复可达50%。经过多次纯化，杜雨苍等最终获得了与天然胰岛素相同的正立方体结晶。在发表论文的结论中他们明确指出“从充分苄基化了的胰岛素衍生物能恢复活力这一事实，说明可以通过人工合成的A与B链最后合成胰岛素”[7-8]。根据他们的研究结果，我们决定先分别合成A链和B链，然后用合成的A或B 链分别与天然的B或A链组合成半合成胰岛素，最后用合成的A链与合成的B链完成胰岛素的全合成。

总的合成路线确定后，还有一系列问题需要解决。首先，带有保护基A链和B链的合成，因为侧链的官能团很多，而要按指定顺序连接时，必须对不让其反应的基团加以保护(我们戏称之为穿靴戴帽)。有的保护基需在不同阶段顺利脱除，而有的保护基则要到最后才脱除。所以对于胰岛素中氨基、羧基及侧链官能团的保护基的选择和设计是十分关键的步骤。其次，组成胰岛素的51个氨基酸残基中，除4个甘氨酸残基(Gly) 外，其他47个氨基酸残基均为手性分子，在合成反应的每一步，包括肽键形成及脱保护基时，均要保证手性分子不发生消旋反应，否则将导致胰岛素生物活性失活。所以在设计合成路线时，何处为避免消旋的最佳接头、合成方法的选择以及保护基的选择与脱除条件均为合成的难点。另外，当时大部分合成胰岛素的最基本的原料氨基酸，都要靠外汇进口。为解决这一问题，上海生化所抽调了陈远聪等创建了我国第一个生产氨基酸的东风生化试剂厂，解决合成胰岛素所需氨基酸的燃眉之急[9]。

3、坚持严谨的科学作风

启动和连续注入同位素标记的该氨基酸，血样中的氨基酸迅速达到同位素平衡，只要注入标记氨基酸至采样时间足够短，合成到组织蛋白中的标记氨基酸极少解离下来，可以认为静脉中少于动脉的标记氨基酸被用于了组织蛋白的合成。前体底物法通过测定一段时间内标记氨基酸合成到组织蛋白中引起的富集度变化测定组织蛋白的合成速度，此时得到的合成速度一般用每天合成的蛋白质量占该组织蛋白总量的百分比表示（ %/天），称为蛋白质合成比速度（fractional protein synthesis rate, fsr）。动静脉差法的主要问题是，有时动静脉中氨基酸流量的差别很小，甚至在误差范围之内，而且u实际上包括合成到蛋白质中的氨基酸和被氧化分解的氨基酸，若能同时测定氨基酸的氧化产物，则可以得到用于合成到蛋白质中的氨基酸数量。

在合成过程中，制备的大多数肽段均使用两种或两种以上不同的路线或方法去得到同一性质的产物，从而保证目标肽产物结构的正确性。例如在胰岛素A链合成中，北大负责N-端九肽(A1-9) 的合成，由于九肽中有一个-S-S-键小环，结构特殊，在合成时就设计了4+5和5+4两条不同的路线以及不同的接肽方法，得到了分析数据相同的九肽后，才认定了我们的N-端九肽的合成正确无误[10-11]。由于当年没有质谱、核磁共振等现代光谱分析手段，所有小肽均要通过元素分析、氨基酸的定量分析、不同溶剂系统的纸层析(因为那时没有TLC薄层析板)，以及熔点、电泳、比旋光度、酶解图谱等的测定。只要其中一项分析不过关，就不能进行下一步反应，必须重新合成或经反复纯化后再做分析鉴定。元素分析数据的理论值虽然事先都经过仔细的计算，但是结果出来后，汪猷先生还要亲自再用计算尺(当时尚无计算器) 复审我们的计算是否有误。

中国科学院上海生物化学研究所、上海有机化学研究所和北京大学化学系三个单位经过通力合作，严格、严谨地实干，于1965年9月终于得到了全合成的牛胰岛素结晶。全合成实验重复了四次均得到了牛胰岛素结晶[12-14]。