质粒的提取(碱法)

原理： 碱裂解法及煮沸裂解法提取质粒dna均是基于细菌“染色体”dna与质粒dna变性和复性的差异而达到分离目的。5. 【答案】b【解析】dna分子双链用3h标记的蚕豆根尖细胞移入普通培养液中培养，依据dna分子的半保留复制，在第一个有丝分裂间期dna完成复制后，每个亲代dna分子经过复制形成的2个子代dna分子都有1条链含有3h、另一条链不含有3h，这两个dna分子分别存在于同1条染色体所含有的2条姐妹染色单体上，因此若检测到a染色体，说明该细胞已经进入第一个细胞周期，a错误。离心，质粒dna留在上清，蛋白质与染色体dna呈絮状沉淀下来。

Solution(现用现配制)0.2 mol/L NaOH 1% SDS Solution（100 ml） 5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 28.5ml 配制成的溶液含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 （pH 4.8）。 氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰 箱保存备用。 A）溶于10mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成 10 mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓 慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。 氯仿，乙醇，70%乙醇。 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50mlLB液体培养基 （含Amp 0.1 mg/ml ）中，37振荡培养过夜。 将菌液倒入1.5ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心 1min，去掉上清液，重复两次。沉淀悬于200μL SolutionI 加入300μLSolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3 放置5min。 加入300μLSolutionIII,混匀（注意动作轻） ，冰箱3 放置5min。 12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf管中，注意所取体积（约600 ），混匀（注意动作轻）。

将混合物在0℃下捣碎15~20min，匀浆后用4层纱布过滤，30000g离心45min， 上清液用饱和(nh4)2so4（ph 7.0）盐析，取20%~35%的蛋白质段，沉淀用5ml含35%饱和(nh4)2so4的缓冲液（20 mmol/l hepes-koh ph 7.0, 0.4 mmol/l atp, 10 mmol/l dtt, 100 mmol/l kcl）悬浮，10000g 离心10min后，沉淀用3ml不含(nh4)2so4的缓冲液溶解，离心，经sephadex g-25（1.5×20cm）脱盐，用缓冲液平衡和洗脱，收集到的蛋白质峰在液n2中过夜。混浊情况视细菌对氧气需求的不 同而有所不 同好氧菌仅使上部培养液混浊厌氧菌使底部培养液混浊兼性厌氧菌使培养液上下均匀混浊有的细菌可在培养液表面形成菌环或菌膜或在底部产生沉淀。取2ml灭过菌的一次性塑料注射器，用注射器推杆将灭过菌的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度约为0.5cm，然后向注射器筒中加入te缓冲液浸透的葡聚糖凝胶g-200，制成简式离心层析柱，再置于10ml的离心管中，于高速冷冻离心机上以3000r/min离心20min，去除葡聚糖凝胶g-200中的te缓冲液，将离心层析柱再置于另一10ml的离心管中，在离心层析柱顶部加入50ul粗土壤dna/index.html'>dna，以10 min为周期于3000r/min离心，分别收集层析液。

向Spincolumn 内加650μl Wash Buffer，于12， 000g 离心30～60 秒，并弃去接液管内液体。 重复第8步一次。 10.再次于12，000rpm 离心1 分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中。如不进行 该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。 11.向Spin column 内加20μl Elution Buffer、去离 子水或TE 溶液，并于室温静置1 分钟。 12.于12碱法提取质粒，000rpm离心1 分钟，1.5ml 离心管内溶 液中含有质粒DNA。 13.提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生 物学实验，如果不立即使用，请保存于-20。 碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大碱法提取质粒，便于操作。