碱法提取质粒DNA.doc

碱法提取质粒DNA一、目的掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用掌握碱法提取质粒DNA的原理和方法。二、原理 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。首先用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体碱法提取质粒，再加入溶液II（NaOH、SDS）后，碱性环境下菌体的细胞壁裂解，而使质粒缓慢释放出来，并且碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主染色体DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在上清液中。然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA 。三、仪器设备、材料与试剂仪器设备恒温培养箱 恒温摇床 台式离心机 高压灭菌锅 制冰机 电子天平pH计量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL） 烧杯（50 mL，100 mL碱法提取质粒，500 mL，1 000 mL） 一次性手套 无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码）玻璃棒 称量勺 微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）酒精灯 灭菌的1.5 mL离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL），相应的吸头盒 吸水纸250mL三角瓶材料： 含pKS质粒或pUC系列质粒的大肠杆菌。

c：将(b)及蒸馏水加入反应瓶，搅拌下滴加10％naoh溶液至(b)全溶，调ph为7-8，减压除水至干，再加入80-90％含量的乙醇，加热回流30分钟，过滤，滤液冷却析晶4小时以上，过滤，滤饼用80-90％含量的乙醇重结晶，即得硫酸黄连素成品，质量符合标准要求。灭菌注射用水 、注射用水经灭菌所得的水 、经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜方法制得的供药用的水 、纯化水经蒸馏所得的水 31、a。你这也太简单了吧，那么多水，还都是水，没有缓冲就放进去，瞬间水解，颗粒会很大，这哪是作材料啊，先调好ph在滴加啊，再说了应该都放溶剂啊，都溶解在乙醇中滴加啊，用拟薄水铝石溶解在乙醇中，调整ph，水溶解在乙醇中调整ph，然后滴加，放1,2ml水就够了，很缓慢的滴加，ph就得摸索了，太酸了很久不溶胶，少了就一会就凝了，你是哪个大学的。

将十四烷基硫酸钠溶解于浓度为10 mm,ph 8.0的磷酸盐缓冲溶液中，在10 ml容量瓶中配制10_2 mol l—1的溶液，进一步用缓冲液做倍比稀释，得到浓度范围为lmol d0_7moll-1的梯度溶液。将十二烷基硫酸钠sds溶解于浓度为10 mm, ph 8. 0的磷酸盐缓冲溶液中，在10 ml容量瓶中配制10_2 mol l—1的溶液，进一步用缓冲液做倍比稀释，得到浓度范围为imoll-1 10_7mol l-1的梯度溶液。在计算溶液配制或溶液稀释等问题中物质的量浓度时，一要注意不能把水的体积当作溶液的体积。

Tris饱和酚（pH7.0）：苯酚需要重蒸后加Tris·HCl pH7.4 制成饱和酚。Tris饱和酚（pH7.0）: 氯仿 : 异戊醇 25 : 24 : 1 Ｖ／Ｖ／Ｖ 五、实验步骤及注意事项步骤注意事项1.2. 吸取1.5mL培养液，12 000r/min离心30s，弃上清液，收集菌体。收集菌体时要尽量除尽水分。3. 加入150μL溶液Ⅰ，在快速混匀器上使菌体均匀悬浮，冰上放置3min左右。菌体在溶液I和溶液Ⅱ中悬浮要尽量均匀。整个过程动作轻柔，防止提取的DNA链断开。如果想去掉RNA，可以在溶液I中加入100μg/mL的RNase, 一般来说RNA对操作过程影响不大，且易在放置过程中分解。4. 加入200μL溶液II，轻柔颠倒混匀，放置冰上不能超过5min。 悬浮要尽量均匀。整个过程动作轻柔，防止提取的DNA链断开。5. 加入150μL溶液III，颠倒混匀，冰上放置10min左右，使细胞壁和蛋白质等杂质沉淀。6. 12 000r/min离心10min, 0~4℃。7. 吸上清液移到另一管中，得到上清液400μl，则加入400μl 25:24: 1体积混合的饱和酚、氯仿、异戊醇溶液振荡混匀，12000r/min 离心2min，取上清液。

回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒dna沉淀出来。溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min，加125ul 20%sds振荡处理15min，离心，分装ep管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200ul te 溶解。做蛋白质组学的前处理要用10%的tca/丙酮沉淀蛋白，之后用丙酮洗沉淀(沉淀要打散，不能呈块状)2~3次，离心去掉丙酮，剩余的一点点丙酮很容易就挥发了，立即加入蛋白质溶解液。