质粒提取原理及碱法

质粒提取原理0 V$ F) _: `$ T+ b, ?+ Q

质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

分离质粒dna有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒dna。 蛋白质的分离与纯化 第三节 质粒dna的提取与纯化 质粒dna提取与纯化的基本步骤 三个基本步骤： 细菌的培养（质粒dna的扩增） 细菌的裂解（质粒dna的释放） 质粒dna的分离与纯化 细菌细胞壁裂解是关键。 原理： 碱裂解法及煮沸裂解法提取质粒dna均是基于细菌“染色体”dna与质粒dna变性和复性的差异而达到分离目的。

3 z# ]- ?) {: G/ Y 在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型。

道中的l dna 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于oc dna 和 sc dna 之间。山东曝气器生产厂家，混式曝气器采用多层螺旋切割的形式进行充气曝气，当气流进入旋混式曝气器时，气流首先通过二道螺旋切割后进入下层多层齿形布气头，进行多层切割，使气泡切割成微气泡，这样大大提高了氧的利用率，具有布气均匀碱法提取质粒，充氧效率高的特点。曝气头价格，混式曝气器采用多层螺旋切割的形式进行充气曝气，当气流进入旋混式曝气器时，气流首先通过二道螺旋切割后进入下层多层齿形布气头，进行多层切割，使气泡切割成微气泡，这样大大提高了氧的利用率，具有布气均匀，充氧效率高的特点。

质粒小量提取之碱裂解法! f# g# }% ^, z/ r

试验原理：

; j& `5 V7 d) z6 [ 碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。

/ G. W& ]! Q; e: y8 z试验准备：# A; \9 J8 X+ w6 Z! z

1、溶液Ｉ:pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/i* R& U3 b7 q- m! M; h7 c

n2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于４℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子. f" `. g, Q8 G6 ~* c1 q5 f

的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2＋和Mg2 ＋等二价金1 T) ^; ]6 j" d$ E# ]* s

属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase

( j7 B% z% Z; u) D( R5 \; m 对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。5 X8 V2 s% [. D: y+ a i, u

2、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1％的SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的

2 S) E }" T7 Z8 e( \( W CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶

2、叶绿体：(呈扁平的椭球形或球形，具有双层膜，主要存在绿色植物叶肉细胞里)，叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，是植物细胞的“养料制造车间”和“能量转换站”，(含有叶绿素和类胡萝卜素，还有少量dna和rna，叶绿素分布在基粒片层的膜上，在片层结构的膜上和叶绿体内的基质中，含有光合作用需要的酶)。最简单的动物：原生动物是体形微小、结构最简单的动物，象草履虫、变形虫、疟原虫等等，这类动物分布很广，生活在淡水、海水以及潮湿的土壤中，也有少数是寄生的，说它们结构简单是因为象草履虫这样的整个身体只是一个细胞，细胞表面是表膜，表膜上面长满纤毛。megsin是一种在肾脏系膜细胞优势表达的基因，在iga肾病、糖尿病等以系膜细胞增生、系膜基质积聚为主要病理改变的肾脏疾病中，其基因与蛋白表达水平均显著上调［1-2］，megsin转基因小鼠出现与人类iga肾病相似的肾脏病理改变［3］. 我们以往的研究发现，megsin基因3′端非翻译区c2093t和c2180t多态性与中国汉族人群iga肾病的发生显著相关［4］.。

即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋

) i/ e: F* e1 `" T. q8 A# t0 G 白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白 X# U% L" D# y5 V0 o6 P1 P

质变性而沉淀下来。 SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步) c9 e, x3 t! Z$ Q2 ]6 P6 E

试验的更好进行。

电离平衡与溶液的ph专题． 【分析】根据醋酸是弱电解质，则室温下向10mlph=3的醋酸溶液中加水稀释将促进电离，离子的数目增多，但溶液的体积增大，则电离产生的离子的浓度减小，并利用温度与电离常数的关系、酸碱混合时ph的计算来解答．。乙酸在水溶液中是一元弱酸，酸度系数为4.8，pka=4.75（25℃），浓度为1mol/l的醋酸溶液（类似于家用醋的浓度）的ph为2.4，也就是说仅有0.4%的醋酸分子是解离的。c．邻苯二甲酸氢钾可用于标定naoh溶液的浓度，假如称量邻苯二甲酸氢钾时电子天平读数比实际质量偏大，则测得的naoh溶液浓度比实际浓度偏小。

离子浓度为5mol/L. pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存

②25℃时向50ml的sn2+、cu2+浓度均为0.01mol/l的混合溶液中逐滴加入na2s溶液，当na2s溶液加到150ml时开始生成sns沉淀，则此时溶液中cu2+浓度为_____________mol/l。在这个阶段中由于从溶液中析出了固体偏钛酸颗粒，打破了原来溶液中的水解平衡，使水解以较大的速度进行，液相中的二氧化钛组分，不断的转为固相偏钛酸的沉淀，溶液中的二氧化钛浓度不断降低，游离酸浓度急剧升高，在这期间也同时发生沉淀粒子的局部溶解和重新析出新的沉淀过程，直至水解过程绪束。是不是这个实验啊1、取1支试管,加入1ml卵蛋清溶液,再加入2%硫酸铜溶液1滴,观察沉淀生成.2、再向试管中加入过量的饱和硫酸铜溶液,观察沉淀的溶解.盐溶液（比如硫酸铜）使蛋白质沉淀的原因不是蛋白质变性而是盐析,少量的盐溶液改变了蛋白质的溶解度,所以在步骤一的时候,溶剂（水）的量相对不足,所以发生了沉淀,但是当加入足够。

: K, a& h) ]+ I' J6 B& j 子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而/ K. c3 d# N7 A) o/ M, @

这种细菌作用中心蛋白复合体与 ps ii 作用中心蛋白复合体的相似性暗示细菌和高等植物在进化上存在相关性。将具有奇特晶体结构的铝镁复合盐加入弱碱缓冲液，搅拌成为悬浮液装入瓶中，加入珍珠后搅拌使珍珠与悬浮液混合后通过自然沉降而被均匀包埋在铝镁复合盐中，恒温水浴数天对无光、弱光珍珠有较显著的增强光泽作用。小凹和小凹蛋白参与囊泡运输、细胞内外钙稳态、胆固醇稳态和内吞作用[5,11]. 此外，它们还在信号转导、细胞增殖和肿瘤进展中发挥重要作用[12-13]. 从功能上看，小凹和小凹蛋白对于区室化和各类信号分子(包括受体和非受体酪氨酸激酶，血管内皮型一氧化氮合酶，和小 gtp 酶等)的浓度以及干扰下游许多蛋白质和癌基因蛋白(如 c-src、h-ras 和增殖作用蛋白激酶等)的活性和信号转导至关重要[5-6,11]. 最近的研究也表明，小凹蛋白可以独立发挥他们的作用，无论是在有小凹的细胞(如心肌细胞和成纤维细胞)，还是那些缺乏小凹的细胞(如神经元和白细胞)中发挥作用[14]. 因此，这些发现表明，小凹蛋白功能的实现不一定依赖于小凹的存在，这些蛋白质可能发挥与他们相关的小凹以外的和其他相关的生物学作用。

1.分别采用直接沉淀法、沉淀转化法制备了分散性好、粒径小的纳米硫酸钡，并研究不同反应条件对产物的影响:研究表明加料速度、反应物浓度、分散剂用量对产物的分散性和粒径大小有影响。乳胶漆行业--由于重量原因, 沉淀钡仅能用于乳胶漆,主要用于高光度与绸纹漆,并有”耐酸” 乳胶漆之称. 甚至于暴露时亦有耐酸性能. 沉淀钡的易分散性,保旋光性与易留动性可增加其化学性能. 沉淀钡能用于高光漆与乳胶漆漆与厚浆涂料--沉淀钡具有高填充性可应用于所有涂装系列,例如,底漆,厚浆涂料等所有类型,其低比表面积与粒径分部性及易流动性,使沉淀钡于加工过程中具有低磨损性,沉淀钡推荐用于自动底漆表面层,甚至于高填充时亦保持很好的均匀与光滑度。针对传统环氧氯丙烷生产工艺中二氯丙醇皂化过程产生大量高碱度、高含盐量有机废水问题,提出利用生物法转化二氯丙醇合成环氧氯丙烷的绿色工艺.利用表达重组卤醇脱卤酶的大肠杆菌全细胞为生物催化剂,考察了ph、温度、全细胞菌体添加量、底物浓度等对生物转化过程的影响.结果表明,优化的工艺条件为：最适ph为8.3,最适反应温度为45℃,全细胞菌体添加量为10 mg（dcw）/ml,底物浓度为20 mmol/l,在此条件下转化8h后,l,3-二氯丙醇的最高转化率可达92.3％.全细胞生物催化剂重复反应3次后活力仍保留在80％以上,显示了其良好的应用前景.。

! m2 T# _3 t: Q0 U: F DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。: i) `5 V: B: g" R- V2 T

稳定性：在通常贮存的条件下稳定.溶于丙酮和甲醇,那么应该溶于大部分的有机溶剂,你可以试试异辛酸（228℃） ,或者是硝基乙烷 114.0 辛烷 125.67 几乎不溶于水,微溶于乙醇,与醚、丙酮、石油醚、苯、氯仿、汽油混溶乙酸丁酯 126.11 优良有机溶剂,广泛应用于医药行业,还可以用做萃取剂氯苯 131.69 能与醇、醚、脂肪烃、芳香烃、和有机氯化物等多种有机溶剂混溶对二甲苯 138.35 不溶于水,与醇、醚和其他有机溶剂混溶二甲苯 138.141.5 不溶于水,与乙醇、乙醚、苯、烃等有机溶剂混溶,乙二醇、甲醇、2-氯乙醇等极性溶剂部分溶解间二甲苯 139.10 不溶于水,与醇、醚、氯仿混溶,室温下溶解乙睛、dmf等醋酸酐 140.0 邻二甲苯 144.41 不溶于水,与乙醇、乙醚、氯仿等混溶环己酮 155.65 与甲醇、乙醇、苯、丙酮、己烷、乙醚、硝基苯、石油脑、二甲苯、乙二醇、乙酸异戊酯、二乙胺及其他多种有机溶剂混溶糠醛 161.8 与醇、醚、氯仿、丙酮、苯等混溶,部分溶解低沸点脂肪烃,无机物一般不溶邻甲酚 190.95 微溶于水,能与乙醇、乙醚、苯、氯仿、乙二醇、甘油等混溶n,n-二甲基苯胺 193 微溶于水,能随水蒸气挥发,与醇、醚、氯仿、苯等混溶,能溶解多种有机物对甲酚 201.88 n-甲基吡咯烷酮 202 硝基苯 210.9 喹啉 237.10 乙二醇碳酸酯 238 二甘醇 244.8。11．下列鉴别方法不可行的是()a．用水鉴别乙醇、甲苯和溴苯b．用燃烧法鉴别乙醇、苯和四氯化碳c．用碳酸钠溶液鉴别乙醇、乙酸和乙酸乙酯d．用酸性高锰酸钾溶液鉴别苯、环己烯和环己烷解析：选da中，乙醇溶于水，甲苯比水密度小，溴苯比水密度大。c：将(b)及蒸馏水加入反应瓶，搅拌下滴加10％naoh溶液至(b)全溶，调ph为7-8，减压除水至干，再加入80-90％含量的乙醇，加热回流30分钟，过滤，滤液冷却析晶4小时以上，过滤，滤饼用80-90％含量的乙醇重结晶，即得硫酸黄连素成品，质量符合标准要求。