工程菌β-胡萝卜素累积及提取条件优化的研究.pdf

类胡萝ｈ素广泛分布于多种植物的色素体中，Ｂ．胡萝Ｉ－素（ｃ４０Ｈ５６，分子量 ５３６．８８）是世界上广泛分布的类胡萝ｌ－素中的一种。 基于上述考虑，以１３．胡萝卜素次级代谢产物为研究目标，用特定肿瘤细胞／ 抑制／增殖试验（ＭＴＴ试验）为检测指标，对昼．胡萝ｈ素在相对温和条件下的 不完全氧化方法进行筛选，并对其不完全氧化降解产物进行分离、纯化，从中 找出具有生物活性的组分并鉴定其化学结构，经与相同条件下分子状态９．胡萝 卜素作用效果的对比，建立两者之间的内在联系胡萝卜素可研，从而弄清Ｂ．胡萝ｈ素生理作 用的内在机制。对ｐ一胡萝ｈ素进行控制型氧化后，对Ｂ一胡萝ｈ素和ｐ一胡萝ｂ素氧化降 解产物进行高效液相检测（图３－１），以同浓度的８一胡萝卜素作为外标，检测其 氧化发现试验４其氧化降解产物中Ｂ一胡萝ｈ素含量Ｏ．５１％，可认为是完全控制 型氧化，氧化降解产物所具有的各种作用来自于反应产物，而不是Ｂ一胡萝卜素。

本章主要研究了光、温度、ｐＨ值、金属离子、防腐剂、蔗糖与食盐、还原 剂、氧化剂等对胡萝Ｉ－索稳定性的影响，主要结论如卜．： Ｏ一胡萝ｂ素对光敏感，尤其是日光。2、胡萝卜素黄色结晶，学性质，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等脂性有机溶．常采用萃取提取胡素．取流程为：胡萝卜-粉碎-干燥-萃取-滤-尿素-萝素．萃剂的特点具有较的沸点，能够充溶解胡且不与水混溶． 要考虑人体是否毒性等全问题．。１８一胡萝 卜素作为食品添加ｉｆｌＩ和营养增补剂已被联合国粮农组织和世界卫生组织食品添 加剂联合专家委员会推荐，被认定为Ａ类优秀营养色素，并在世界５２个国家和 地区获准应用。

· 21 ·山西农业科学 2010年第38卷第4期 组质粒，两重组质粒共转化大肠杆菌，获得了累 少 ，与对照(不加诱导剂 IPTG)相当，这可能是 积 B一胡萝 卜素的工程菌。由于在试验过程中光照、温度等因素使其降解本试验总结了国内外学者的试验方法和经所致。综上所述 ，IPTG诱导 1．25h时，最有利于 验，使 B一胡萝 b素于原核生物 (EcoliDH5 ) B一胡萝 b素的积累。 中进行表达，优化 B一胡萝 b素累积及提取方表 1 不 同诱导时间下样品在波长 446。475。508nm 时的吸光度值 法，使其表达量和提取量达到最佳，旨在解决人 们对它与 日俱增的需求问题。 1 材料和方法 1．1 菌种菌株 (EcoliDH5 ，含 pACCAR16AcnX)， 由山西农业大学生命科学学院实验室保存。2．2 不同浓度诱导剂 IPTG在相 同诱导时间下 1．2 方法对工程菌积累D一胡萝 卜素的影响挑取大肠杆菌工程菌单菌落，接种于5mL取培养好 的5份菌液分别编号 ，并加入 LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取2mL IPTG使其终浓度分别为 0．2，0．5，0．8，1．0，2．0 菌液加人 100mL培养基中，扩大培养约3～4h。

mmollL，诱导 1．25h后取出，按 1．2方法提取 然后将菌液分成若干份 ，保存于4cC冰箱中待B一胡萝 卜素，并用分光光度计对以上样品进行 用。将培养好的菌液分别编号并加人诱导剂吸光度值的测定。 IPTG，放人摇床进行诱导，取出后 3000dmin离从表2可以看出，随着 IPTG终浓度的增加， 心收集菌体。称重加入4mol／L的HCI水浴破壁， 样品在不同波长下的吸光度值呈先增加后减少 然后直接加入丙酮进行抽提，4000r／min离心的趋势，即 B一胡萝 b素的积累量呈现出先增加 15min(上清液于4℃暗处保存)，沉淀用少量丙后减少的趋势(OD值先增加后减少)；IPTG终浓 酮再抽提2次，合并3次的上清液，加入 1mL氯 度为0．8mmol／L时，所得氯仿抽提液的OD值达 仿，3000r／min离心 8min，弃上清液，最后测定最大，也就是说，此时工程菌的 B一胡萝 b素积 下层液体的OD值。累量达最大。这说明低浓度 IPTG诱导可促进B一胡萝 b素的大量 、高效积累，而高浓度的 2 结果与分析IPTG可能对细胞具有一定的毒害作用，致使工 2．1 诱导时间对工程菌累积B一胡萝 卜素的影响程菌死亡，无法大量表达 目的产物 B一胡萝 b取培养好的5份菌液分别编号，并加人等量素。

因此可以得出，工程菌在0．8mmol／LIPTG诱 的诱导剂 IPTG使其终浓度为0．5mmol／L，放入导下，最有利于 B一胡萝 卜素的积累。 摇床，分别诱导 1．25，2．25，3．25，4．25h，按 1．2提表 2 不 同诱导剂 IPTG量的样品在波长 446。475．508nm 下的吸光度值 取方法进行 B一胡萝 b素的提取，再用分光光度 计对以上样品测定其在446，475，508nm波长下 的吸光度值，同时以不加 I／riG的菌液作为对照。从表 l可以看出，随着诱导时间的延长，样 品在不同波长时的吸光度值总体上呈先增加后 减少的趋势，即 B一胡萝 b素的积累量先增加后 减少，诱导时间为 l_25h时，3种波长下所得到2．3 菌液不同OD值对工程菌积累B一胡萝 卜素 的OD值均为最大，其平均值分别是2．25h的6 的影响 倍和3．25h的2倍，即在 IPTG诱导 1．25h时，工由于 IPTG高效启动重组菌外源基因的表达 程菌的B一胡萝 b素积累量达最大。这是因为随时需要消耗能量，而菌体本身的生长也需要吸收 着诱导时间的增加，细菌密度增大，生活活力降能源物质，二者之间存在一定的竞争作用 ，这就 低，甚至死亡，致使 B一胡萝 卜素不能合成进而要求把握好 IPTG诱导的时机。

积累；而诱导2．25h时，p一胡萝 卜素积累量最表 3显示，随着菌液0D鲫值的增加，样品在 · 22 ·冯亦平等：32程菌 B一胡萝 卜素累积及提取条件优化的研究 不同波长下的吸光度值总体上呈先增加后减少表 3 不 同OD值 的菌液经实验后样 品在 446。475．508nm 的吸光度值 的趋势，即B一胡萝 卜素的积累量整体上呈现出 先增加后减少的趋势，当菌液OD锄值为0．6时， 所得到的氯仿抽提液的OD值达最大，即此时工 程菌的 13一胡萝 b素积累量达最大。这可能是由 于菌液OD 值较低时，工程菌可能正处于迟缓 期，此时加入 IPTG，结果会导致菌体的生长繁殖 大受影响；而菌液OD鲫值较高时，工程菌处于稳2．4 盐酸量对p一胡萝 卜素提取量的影响 定期或衰亡期 ，有害代谢产物积聚，细菌繁殖开把收集到的 13一胡萝 卜素按 1．2试验方法 始变慢，死亡数增加，不利于 13一胡萝 b素积累。 提取(其中，HC1和丙酮分别按5，10，15，20mL]g 综上所述，OD种值为0．6的菌液最适合 B一胡萝(湿菌体)加入)，并用紫外分光光度计法测定其 b素的积累。

萝卜地用于医药食晶．从胡卜中提取胡萝卜素采用取法．萃取胡萝卜素的有机溶剂应该有较高的沸，能充分胡萝素为了防止热机溶剂挥发，还在加热瓶口安装回流冷凝装置．一般来说原料颗粒越小，含量少，萃取效果越好所以取前胡萝卜素可研，要将胡卜进行碎和干燥，萃取液的缩可直接用蒸装置．。 基于上述考虑，以１３．胡萝卜素次级代谢产物为研究目标，用特定肿瘤细胞／ 抑制／增殖试验（ＭＴＴ试验）为检测指标，对昼．胡萝ｈ素在相对温和条件下的 不完全氧化方法进行筛选，并对其不完全氧化降解产物进行分离、纯化，从中 找出具有生物活性的组分并鉴定其化学结构，经与相同条件下分子状态９．胡萝 卜素作用效果的对比，建立两者之间的内在联系，从而弄清Ｂ．胡萝ｈ素生理作 用的内在机制。对ｐ一胡萝ｈ素进行控制型氧化后，对Ｂ一胡萝ｈ素和ｐ一胡萝ｂ素氧化降 解产物进行高效液相检测（图３－１），以同浓度的８一胡萝卜素作为外标，检测其 氧化发现试验４其氧化降解产物中Ｂ一胡萝ｈ素含量Ｏ．５１％，可认为是完全控制 型氧化，氧化降解产物所具有的各种作用来自于反应产物，而不是Ｂ一胡萝卜素。

把收集的 13一胡萝 卜素按 1．2试验方法提2．7 丙酮量对 8-胡萝 卜素提取量的影响 取(HC1破壁温度为 30，35，40，45，5O，55℃，HCI把收集的 B一胡萝 b素按 1．2试验方法提 处理时间为20min，丙酮抽提时间为 1．5h)，用取 (其中，HCI和丙酮分别按 lO，20，3O，40mL／g 紫外分光光度计法测其中的 13一胡萝 卜素含量。 (湿菌体)加入)，用紫外分光光度计法测其中的由表6可知，随着HC1破壁温度的逐渐升B一胡萝 b素含量。 高，最后测得的OD值即 13～胡萝 卜素的提取量由表 7可知，随着丙酮量的增加，最后测得 也逐渐增大，当HC1破壁温度为40℃时，B～胡的OD值即 B一胡萝 卜素的提取量也逐渐增大， 萝 卜素的提取量达到最大；再升高温度可能会使当丙酮量为2．4OmL时，13一胡萝 卜素的提取量 B一胡萝 b素受热分解，从而致使提取量逐渐降 达到最大，再增大丙酮量则会使 B一胡萝 b素的 低。因此，HC1处理温度为40℃时，最后测得的提取量逐渐降低。因此，可以得知丙酮量为2．40mL． 23 ·山西农业科学2010年第38卷第4期 即20mL／g(湿菌体)时，最后测得的OD值最大， B一胡萝 卜素提取效果最好。

对于Ｈｅｌａ细胞，ｅ一胡萝ｈ素在０．０２５０９／Ｌ和０．０５００ ｇ／Ｌ时，测得的吸光度 仅为０．２３３和Ｏ．２７５，远远低于空白对照（吸光度为Ｏ．５２８），Ｂ一胡萝ｈ素氧化降 解总产物对Ｈｅｌａ细胞的抑制呈现剂量效应关系，随着浓度的提高，其吸光度逐 渐下降，在０．２０００ ｇ／Ｌ浓度下，测得的吸光值达到最小值（Ｏ．２６５）。对ｐ一胡萝ｈ素进行控制型氧化后，对Ｂ一胡萝ｈ素和ｐ一胡萝ｂ素氧化降 解产物进行高效液相检测（图３－１），以同浓度的８一胡萝卜素作为外标，检测其 氧化发现试验４其氧化降解产物中Ｂ一胡萝ｈ素含量Ｏ．５１％，可认为是完全控制 型氧化，氧化降解产物所具有的各种作用来自于反应产物，而不是Ｂ一胡萝卜素。 基于上述考虑，以１３．胡萝卜素次级代谢产物为研究目标，用特定肿瘤细胞／ 抑制／增殖试验（ＭＴＴ试验）为检测指标，对昼．胡萝ｈ素在相对温和条件下的 不完全氧化方法进行筛选，并对其不完全氧化降解产物进行分离、纯化，从中 找出具有生物活性的组分并鉴定其化学结构，经与相同条件下分子状态９．胡萝 卜素作用效果的对比，建立两者之间的内在联系，从而弄清Ｂ．胡萝ｈ素生理作 用的内在机制。

萝卜地用于医药食晶．从胡卜中提取胡萝卜素采用取法．萃取胡萝卜素的有机溶剂应该有较高的沸，能充分胡萝素为了防止热机溶剂挥发，还在加热瓶口安装回流冷凝装置．一般来说原料颗粒越小，含量少，萃取效果越好所以取前，要将胡卜进行碎和干燥，萃取液的缩可直接用蒸装置．。 基于上述考虑，以１３．胡萝卜素次级代谢产物为研究目标，用特定肿瘤细胞／ 抑制／增殖试验（ＭＴＴ试验）为检测指标，对昼．胡萝ｈ素在相对温和条件下的 不完全氧化方法进行筛选，并对其不完全氧化降解产物进行分离、纯化，从中 找出具有生物活性的组分并鉴定其化学结构，经与相同条件下分子状态９．胡萝 卜素作用效果的对比，建立两者之间的内在联系，从而弄清Ｂ．胡萝ｈ素生理作 用的内在机制。本章主要研究了光、温度、ｐＨ值、金属离子、防腐剂、蔗糖与食盐、还原 剂、氧化剂等对胡萝Ｉ－索稳定性的影响，主要结论如卜．： Ｏ一胡萝ｂ素对光敏感，尤其是日光。

类胡萝ｈ素广泛分布于多种植物的色素体中，Ｂ．胡萝Ｉ－素（ｃ４０Ｈ５６，分子量 ５３６．８８）是世界上广泛分布的类胡萝ｌ－素中的一种。该研究对于避免Ｂ．胡萝ｈ素在高自由基浓度下对人的潜在危 害、解释类胡萝｝素物质可能的代谢途径等具有重要指导作用，并有可能发现 新的生物活性成分，对ｐ．胡萝ｈ素等类胡萝ｈ素成分的应用具有重要指导意 义。对ｐ一胡萝ｈ素进行控制型氧化后，对Ｂ一胡萝ｈ素和ｐ一胡萝ｂ素氧化降 解产物进行高效液相检测（图３－１），以同浓度的８一胡萝卜素作为外标，检测其 氧化发现试验４其氧化降解产物中Ｂ一胡萝ｈ素含量Ｏ．５１％，可认为是完全控制 型氧化，氧化降解产物所具有的各种作用来自于反应产物，而不是Ｂ一胡萝卜素。