β胡萝卜素氧化降解产物及其生理活性研究.pdf(2)

这从另一个侧面说明13．胡萝h素发挥作用并不一定要转变成维生素A。B-胡 萝h素与胃癌、食管癌等其它部位的癌症危险性降低有一定的关系M。自提出膳食中类胡萝h素可能降低人类癌症发生率【43】以来，越来越多的研江南大学硕士学位论文 究表明，多食用水果和蔬菜可以降低人体罹患某些癌症的危险[44,4卯，并且认为 这是由于其中的类胡萝卜素、特别是B．胡萝b素的作用。然而一项在芬兰进行历时5～8年的13．胡萝卜素(每H20mg)和维生素E(每 日50mg)干预试验得到的结果表明服用6．胡萝b素不但没有降低这些吸烟者的 前列腺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、胃癌和肺癌的发病率，反而使肺癌发病率比 对照组升高了18％。据此该研究小组认为补充18．胡萝h素对吸烟者可能是有 害的14“。芬兰试验的结果提示，对其它已得到满意结果的13．胡萝卜素干预试 验应重新评估。而在美国开展的CARET(13一胡萝b素和视黄醇)干预试验也未 得出18．胡萝卜素有有益作用的结果[471。 1．3．718一胡萝b素与其他疾病HIV病毒感染病人即使在正常饮食条件下，其血液中微量营养素浓度也会 有所下降。据Coodlcy等【48】报道，HIV阳性妇女血液中番茄红素、n．胡萝b 素、6．胡萝p素等的浓度均较正常值偏低。

曾经有人认为氧化物对机体的破坏可导致中枢神经系统的疾病，如早老性 痴呆、帕金森病(振颤麻痹)及多发性硬化症等，而在目前，有关类胡萝p素物 质对这些疾病影响的研究还进行得非常少。有研究表明，摄入富含13一胡萝h素能够降低冠状动脉疾病的发病率[491。 StaigWt501的研究证实，口服B一胡萝卜素后发生光敏性红斑者数量明显减少， 同时§一胡萝卜素对白斑症、白化症也有一定的预防作用。沈莉【5”等进行心肌1 细胞缺氧实验发现lff2tiffmmol／L的18-胡萝}素对心肌细胞缺氧具有抗氧 化保护作用，这说明经8．胡萝卜素预处理的心肌细胞内保持有抗氧化机制。另 外天然13．胡萝h素还有细胞内抗突变[521及降低脑血管病危险等作用【53一。 1．4国内外13一胡萝b素的应用及研究现状目前世界上B一胡萝h素的年消费量大约有1430吨，其中天然胡萝卜素占35 吨，化学合成的占1395吨，而目前的需求量正以每年7％～9％的速度增长。我 国p一胡萝卜素的年销售量约为4～5吨，基本上以从国外进口为主。18一胡萝 卜素作为食品添加iflI和营养增补剂已被联合国粮农组织和世界卫生组织食品添 加剂联合专家委员会推荐，被认定为A类优秀营养色素，并在世界52个国家和 地区获准应用。

对ｐ一胡萝ｈ素进行控制型氧化后，对Ｂ一胡萝ｈ素和ｐ一胡萝ｂ素氧化降 解产物进行高效液相检测（图３－１），以同浓度的８一胡萝卜素作为外标，检测其 氧化发现试验４其氧化降解产物中Ｂ一胡萝ｈ素含量Ｏ．５１％，可认为是完全控制 型氧化，氧化降解产物所具有的各种作用来自于反应产物，而不是Ｂ一胡萝卜素。３）８一胡萝ｐ素及其氧化降解产物进行生理活性测定，通过形态观察，Ｂ一 胡萝卜素氧化降解产物可以使癌细胞表面粗糙，细胞整体感差，易脱落，迸一步， 细胞贴壁不紧，死亡，并成碎片游离于培养液中。４．Ｂ一胡萝ｈ素氧化降解总产物对Ｂｅｌ．７４０２细胞的作用有明显的剂量效应关。

第四章Ｂ一胡萝ｂ素氧化降解产物生理活性研究。第四章Ｂ一胡萝ｈ素氧化降解产物生理活性研究。３）８一胡萝ｐ素及其氧化降解产物进行生理活性测定，通过形态观察，Ｂ一 胡萝卜素氧化降解产物可以使癌细胞表面粗糙，细胞整体感差，易脱落，迸一步， 细胞贴壁不紧，死亡，并成碎片游离于培养液中。

9江南大学硕士学位论文 1．6本论文主要研究的内容本论文的目的是通过比较13一胡萝h素的氧化方法，选择最佳氧化方法以 及剂量，并对氧化降解产物进行分离，并对分离组分进行生理研究，分析13一 胡萝h素氧化降解对细胞抑制／增殖实验，从而选择有生理活性的组分。即具体 的研究内容包括以下几个方面： 1．B一胡萝h素稳定性研究 2．8一胡萝h素氧化降解条件的研究 3．B一胡萝h素氧化降解产物分离 4．P一胡萝h素氧化降解产物生理研究第二章B一胡萝h素稳定性研究第二章B一胡萝卜素稳定性研究 2．1引言B．胡萝h素由8个异戊间二烯单位从分子中心起首尾连接而成，具有四十个 碳原子的基本结构骨架，分子中均含有一个较长的碳碳双键的共轭体系。由于类胡萝h素物质分子中都含有较多的共轭双键，它们具有很强的抗氧化 活性，可以保护多不饱和脂肪酸、低密度脂蛋白(LDL)及DNA等免受单线态 氧、超氧阴离子、过氧化自由基和羟自由基等活性氧碎片的破坏[631，但也正是由 于它的多双键结构，它对光、热、氧等因素很敏感，容易氧化降解和异构化，一 些金属离子也可以催化其氧化。在提取的过程中如果没有其他介质的保护作用， 在光照、高温和氧气的作用下很容易被氧化分解。

孙庆杰[641与邱伟芬嘲等研究表明番茄红素对Fe抖和Cu2+的稳定性较差，酸 对番茄红素具有较强的破坏作用，对光十分不稳定，尤其是日光直射下一天即可 完全损失。对紫外光也较敏感，在对类胡萝h素稳定性研究中，都表明，类胡萝 h素不同程度的受到光，热或者食品介质的影响[66,67]。刘良忠等人以冻干天然红心蛋粉为原料提取天然红心鸭蛋类胡萝卜素色素 在低温下稳定；对金属离子等不稳定；对二价铁离子及光线极不稳定。常用抗氧 化剂VC，VE，二丁基羟基甲苯(BHT)及常用食品防腐剂对羟基苯甲酸乙酯等对 提取物中的类胡萝h素有保护作用[eq。惠军【叫和孙庆杰【删等研究番茄红素的稳定性，结果表明番茄红素对热、碱、 氧化剂、还原剂等较稳定，但对光十分不稳定。另有研究天然番茄红素对光敏感；Fe3+、cu”引起番茄红素的损失较大；氧化剂、 酸性条件下(pH<6)不稳定； 还原剂、防腐剂、糖对番茄红素的稳定性影响不显著。虽然目前对类胡萝h素的稳定性研究较多，但是更多是研究番茄红素的稳定 性，对B一胡萝h素的稳定性研究较少，而且一般却只限于在某种特定的食品中， 不够系统全面。因此有必要对B一胡萝h素在常见的储存、运输及食品生产环境 下的稳定性作一个全面的分析。

2．2试验材料与方法 2．2．1实验材料江南大学硕士学位论文无水乙醇，无水乙醚，石油醚，丙酮，H202，二氯甲烷，偶氮二异丁腈(AmN)， 以上均为分析纯。争胡萝卜素样品，Fluka公司。 2．2．2实验仪器 ABl04--电子分析天平梅特勒．托利多仪器(上海)有限公司 uV一2102PCS型紫外可见分光光度计尤尼克上海仪器有限公司 恒温干燥箱上海沪南科学仪器联营厂。 HH_4数显恒温水浴锅江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 SK．1快速混匀器苏州金坛环保仪器厂 KQ--250B型超声波清洗器 昆山市超声波仪器仪器有限公司 T(m．16G台式高速离心机上海医用分析仪器厂 SHB．Ⅲ循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司 真空旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器 2．2．3实验方法 2．2．3．1p一胡萝卜素的光谱特征取一定量B一胡萝h素样品，溶解于乙醚溶液中，在200—55013111范围内进行’ 进行紫外扫描分析。一J 2．2．3．2光对p一胡萝I-素稳定性的影响mL，分别将B一胡萝h素样品溶解于沸程为60～90℃的石油醚中，取50 置于室内暗处、室内散射光、室外目光和紫外光下，定时取样测定吸光度。

2．2．3．3温度对p一胡萝卜素稳定性的影响mL，分别置于不同取适量p一胡萝卜素溶于石油醚(90～120"C)，各取25 的温度的恒温水浴中保温，各做三个重复，定时取样，用自来水冷却至室温，并 再次定容后在450rim下测定吸光度。第二章口～胡萝}素稳定性研究 2．2．3．4pH值对p一胡萝I-素的影响由于p一胡萝卜素不溶于水，但溶于丙酮与水的混合液，因此将p一胡萝b 素溶解于一定量丙酮溶液中，用柠檬酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠配制pH分别为mL缓冲液于5 2．0、3．0、4．0、5．0、7．0、9．0、11．0的缓冲液，准确移取5 mLB 一胡萝b素丙酮溶液中，用vii计测pH值，室温暗处放置，定时取样测定吸光 度，对照液为5mL的蒸馏水加5mLB一胡萝卜素丙酮溶液，参比液为5mL的 蒸馏水加5mL丙酮溶液。 2．2．3．5金属离子对肛一胡萝b素稳定性的影响配制含常见金属离子浓度为1 酮溶液中。放置于室温暗处，定时取样测定吸光度。对照液为2mL蒸馏水加10 mLp一胡萝卜素丙酮溶液，参比液为2mL的蒸馏水加10mL丙酮溶液。 2．2。3．6常见防腐剂对p一胡萝卜轰稳定性的影响选用常用的防腐剂苯甲酸钠，根据国家食品添加剂使用卫生标准，防腐剂在 食品中限量为O．02％，因此配置浓度为1．0％苯甲酸钠，取1mL放入一定浓度的 9mLB-胡萝h素丙酮溶液中并充分混匀后，于室温下放置在暗处胡萝卜素可研，定时取样测 定。

2．2．3．7蔗糖与食盐对p一胡萝b素稳定性的影响mL配制O．1％，l％，5％的食盐溶液和1％，5％，10％的蔗糖溶液，各取l 于9mL一定浓度的9mLB一胡萝h素丙酮溶液中，对照液为1mL蒸馏水加9mL 胡萝卜素丙酮溶液，参比液为1mL的蒸馏水加9mL丙酮溶液。在450nrfl处进 行比色分析，以判断食盐和蔗糖对p-胡萝b素稳定性的影响。 2．2．3．8还原剂对p一胡萝b素稳定性的影响选用抗坏血酸和亚硫酸钠作为还原剂，配制O．1％、O．5％、1．O％的溶液，然mL 后吸取2加L抗坏血酸溶液加入到一定浓度的8B一胡萝卜素的丙酮溶液，在 室温暗处放置一定时间后，定时测定。江南大学硕士学位论文 2．2．3．9不同氧化剂对色素稳定性的影响mL加 不同氧化方法之间的作用。配制0．1％、0．5％、1．0％的H202溶液，各吸l 入一定浓度的9n1LB一胡萝卜素丙酮溶液中，在室温暗处放置，定时测定。rnL苯中，用5用AIBN氧化p一胡萝h素，先将5mgp一胡萝h素溶于100另外取浓度为4 mgAIBN在60℃下氧化【70J。peCmL的B-胡萝卜素甲醇溶液4 mL于比色杯中，向其中加入NaCIO溶液10止，在室温下反应[71】。

刮下前三个条带Ａ，Ｂ，Ｃ进行波长扫描后（图３．４），Ａ、Ｂ、Ｃ这三个化合 物与ｐ－胡萝ｂ素（图３－２（ａ））的最大吸收峰相比，都有明显的前移，Ａ、Ｂ、Ｃ 的最大吸收波长分别为３７０。 基于上述考虑，以１３．胡萝卜素次级代谢产物为研究目标，用特定肿瘤细胞／ 抑制／增殖试验（ＭＴＴ试验）为检测指标，对昼．胡萝ｈ素在相对温和条件下的 不完全氧化方法进行筛选，并对其不完全氧化降解产物进行分离、纯化，从中 找出具有生物活性的组分并鉴定其化学结构，经与相同条件下分子状态９．胡萝 卜素作用效果的对比，建立两者之间的内在联系，从而弄清Ｂ．胡萝ｈ素生理作 用的内在机制。萝卜地用于医药食晶．从胡卜中提取胡萝卜素采用取法．萃取胡萝卜素的有机溶剂应该有较高的沸，能充分胡萝素为了防止热机溶剂挥发，还在加热瓶口安装回流冷凝装置．一般来说原料颗粒越小，含量少，萃取效果越好所以取前，要将胡卜进行碎和干燥，萃取液的缩可直接用蒸装置．。

对ｐ一胡萝ｈ素进行控制型氧化后，对Ｂ一胡萝ｈ素和ｐ一胡萝ｂ素氧化降 解产物进行高效液相检测（图３－１），以同浓度的８一胡萝卜素作为外标，检测其 氧化发现试验４其氧化降解产物中Ｂ一胡萝ｈ素含量Ｏ．５１％，可认为是完全控制 型氧化，氧化降解产物所具有的各种作用来自于反应产物，而不是Ｂ一胡萝卜素。 基于上述考虑，以１３．胡萝卜素次级代谢产物为研究目标，用特定肿瘤细胞／ 抑制／增殖试验（ＭＴＴ试验）为检测指标，对昼．胡萝ｈ素在相对温和条件下的 不完全氧化方法进行筛选，并对其不完全氧化降解产物进行分离、纯化，从中 找出具有生物活性的组分并鉴定其化学结构，经与相同条件下分子状态９．胡萝 卜素作用效果的对比，建立两者之间的内在联系，从而弄清Ｂ．胡萝ｈ素生理作 用的内在机制。８一胡萝ｈ素氧化降解产物中６一胡萝ｈ素残留为Ｏ．５ｌ％，可以忽略不计，可以。

而在食用之前对食物进行加热可以提高晶体类胡萝ｐ素的分散 性，同时又可促迸以结合态存在的类胡萝卜素从类胡萝卜素．蛋白质复合体中分 离出来，因而可以提高类胡萝ｈ素物质的生物价［１３，１４１。萝卜地用于医药食晶．从胡卜中提取胡萝卜素采用取法．萃取胡萝卜素的有机溶剂应该有较高的沸，能充分胡萝素为了防止热机溶剂挥发，还在加热瓶口安装回流冷凝装置．一般来说原料颗粒越小，含量少，萃取效果越好所以取前，要将胡卜进行碎和干燥，萃取液的缩可直接用蒸装置．。 ２．２．３．８还原剂对ｐ一胡萝ｂ素稳定性的影响 选用抗坏血酸和亚硫酸钠作为还原剂，配制Ｏ．１％、Ｏ．５％、１．Ｏ％的溶液，然 后吸取２加Ｌ抗坏血酸溶液加入到一定浓度的８。