第一章质粒DNA的分离doc下载(3)

循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经轮循环扩增后,反应中TaqDNA聚合酶已经不足,如果此时产物量仍不够,需要进一步扩增,可将扩增的DNA样品稀释倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经轮循环后,扩增水平可达。扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C(P)n。其中：C为扩增产物量,C为起始DNA量,P为增效率,n为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应,减少非特异性产物。三、PCR产物的克隆在许多研究中,需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。此时,所用PCR循环数应尽量小,以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。平末端连接：由于TaqDNA聚合酶往往在PCR产物'端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR产物前,可用Klenow片段或TDNA聚合酶处理补平末端。在PCR产物尾部加dT或ddT：TaqDNA聚合酶会在'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A。

利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接载体末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体'端只加上一个ddTTP,而其'端所含的磷酸基团可与PCR产物的'端OH连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带'T的TVector。粘性末端连接：利用引物中附加在'端的限制酶位点,直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接,产生重组DNA如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点经酶切后定向克隆到载体中。思考题降低退火温度对反应有何影响？延长变性时间对反应有何影响？循环次数是否越多越好？为何？如果出现非特异性带,可能有哪些原因？实验二DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定实验原理测定核酸通常采用两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。．紫外分光光度法DNA或RNA定量时应在nm和nm两个波长下读数。根据计算在nm波长下每ugmLDNA钠盐的A值为即在A=时双链DNA含量为ugmL单链DNA与RNA含量为ugmL单链寡核苷酸的含量为ugmL。

双链DNA含量＝A××稀释倍数（ugmL）RNA含量＝A××稀释倍数（ugmL）单链DNA含量＝A××稀释倍数（ugmL）此外还可以根据nm和nm的读数间的比值（AA）估计核酸的纯度。实验一质粒DNA的提取和酶切鉴定（学时）二、实验原理基因工程中携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备以下条件：（）是一个复制子载体有复制点才能与它结合的外源基因复制繁殖（）载体在受体细胞中能大量繁殖只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增（）载体DNA链上有到几个限制性内切酶的单一识别和切割位点便于外源基因的插入（）载体具有选择性的遗传标记如有抗氨苄青霉素和四环素的基因常用Ampr和Tcr表示以此知道它是否进入受体细胞也可根据这个标记将受体细胞从其它细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件它是基因工程常用的载体之一。质粒是一种染色体外的稳定遗传因子大小在kb之间具有双链闭合环状结构的DNA分子主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。所用分离质粒的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌分离和纯化质粒DNA。

碱裂法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线状染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在PH值介于～这个狭窄的范围内线性的DNA双螺旋结构解开而被变性尽管在这样的条件下共价闭合质粒DNA的氢键会被断裂但两条互补链仍然彼此相互盘绕紧密结合在一起。当加入PH的乙酸钾高盐缓冲液恢复PH至中性时质粒DNA复性准确而迅速而线性染色体DNA由于两条链已彼此完全解开复性就不会那么迅速准确它们盘绕形成网状结构通过离心染色体DNA与不稳定的大分子RNA以及蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。这种酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力能在这个特异核苷酸序列内切断DNA的双链形成一定长度和顺序的DNA片断。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。在一定的电场强度下DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应即DNA分子的大小和构型。具有不同分子量的DNA片断泳动速度不一样可以分离。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系。凝胶不仅可以分离不同分子量的DNA也可以分离分子量相同但构型不同的DNA。

在细胞内共价闭合环状DNA以超螺旋形式存在。如果两条链中的一条断裂发生一处或多出断裂叫开环DNA如果两条链同时断裂则为线性DNA。这三种构型的质粒DNA分子在凝胶中的迁移率不同。因此电泳后呈条带超螺旋质粒DNA泳动最快其次为线性DNA最慢的为开环质粒DNA。实验二感受态细菌的制备与质粒DNA的转化（学时）二、实验原理转化指外源性DNA被宿主细胞摄取以实现遗传物质转移的过程能摄取外源DNA的细胞称为感受态细胞。被转化的细胞称为转化体而被摄取的DNA称为转化因子。转化因子不同转化能力也不同。感受太细菌可以通过物理或化学方法来制备。物理方法是通过电击使细胞膜的通透性发生暂时性的改变而使DNA分子导入细胞化学方法是通过一些金属离子细菌细胞膜的通透性发生改变通常采用CaCl处理细菌使其成为感受态细菌：用冰冷的CaCl溶液处理细菌后作短暂加热。可使细菌细胞膜的通透性发生改变。即受体细胞产生“感受态”在此期间它们能摄取各种不同来源的DNA通过这种方法可以用质粒DNA转化细胞。实验三DNA重组（学时）一、实验目的通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。二、实验原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。

重组的DNA分子是DNA连接酶的作用下有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能而且T噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低一般可通过提高T噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为步：首先TDNA连接酶与辅助因子ATP形成酶AMP复合物然后酶AMP复合物再结合到具有′磷酸基和′羟基切口的DNA上使DNA腺苷化最后产生一个新的磷酸二酯键把切口封起来。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法为了防止载体本身的自连可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服。连接反应的温度在℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度即~℃连接~h（过夜）这样既可最大限度地发挥连接酶的活性又兼顾到短暂配对结构的稳定。重组质粒转化宿主细胞后还需对转化菌落进行筛选鉴定。

利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列此结构称为lacZ′基因。LacZ′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。LacZ′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶可以用Xgal（溴氯吲哚βD半乳糖苷）显色出来它能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物溴靛蓝。因此任何携带着lacZ′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶在IPTG（异丙基硫代βD半乳糖苷）诱导后在含有Xgal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ′中的多克隆位点后就会破坏α肽链的阅读框从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。实验四植物基因组DNA的提取（学时）一、实验目的掌握植物基因组DNA的抽提方法和基本原理。

二、实验原理DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用是分子生物学和基因工程研究的对象但无论是研究植物DNA的结构和功能还是开展外源DNA的转化、转导的研究首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨材料易于破碎并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethylammomumbromide简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate简称SDS)等离子型表面活性剂能溶解细胞膜和核膜蛋白使核蛋白解聚从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性并使抽提液分相因核酸(DNA、RNA)水溶性很强经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀沉淀DNA溶于TE溶液中即得植物总DNA溶液。实验五基因扩增及检测技术PCR技术（学时）实验原理聚合酶链反应（简称PCR）技术是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术亦称无细胞分子克隆技术。

是在模板DNA、引物和种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。其特异性取决于引物核模板DNA结合的特异性。PCR过程包括三个基本步骤：即双链DNA加热变性在一定温度下引物与单链模板DNA互补配对在适宜温度下TaqDNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸。重复上述三种步骤可以使特异DNA片段扩增数百万倍。实验六DNA片段回收及纯化（学时）实验原理载体及目的DNA片段经酶切后如果无多余的片段（如载体单切）则可以用酚氯仿抽提后经乙醇沉淀回收用于连接。但多数还有多余片段必须等电泳分离后回收目的片段。回收既可以采用低熔点胶法和冻融法等经典方法也可以采用商品化的试剂盒。柱回收试剂盒的原理是将带负电荷的DNA结合到一种阳离子基质上用洗液洗去杂质最后用洗脱液洗出DNA。纯化回收DNA的目的是什么？若DNA纯化回收后的电泳结果为两条带那么可能有那些原因？如何补救？实验一质粒DNA的小量制备【实验原理】根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH这个狭窄的范围内DNA双螺旋结构被解开而变性。尽管在这样的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性但两条互补链彼此互相盘绕仍会紧密结合在一起。

1.4 ct3蛋白纯度的鉴定分别取超声后ct3菌液、酶切之前的gst-ct3融合蛋白、酶切后的沉淀beads和上清ct3蛋白，经5×。dna生命智力系统是由基因和智因组成的，其化学分子结构的基础是脱氧核糖核酸分子（dna）和核糖核酸分子（rna），以及碱基、酶蛋白、组蛋白等有机分子，其中转录酶和逆转录酶发挥着重要的作用。还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。