第一章质粒DNA的分离doc下载(2)

EcoliDHα菌株带有β半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DHα编码的β半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DHα融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α互补。由α互补产生的Lac细菌较易识别,它在生色底物Xgal(溴氯吲哚βD半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代βD半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去α互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上,α互补产生的Lac细菌由于含β半乳糖苷酶,能分解麦康凯培养基中的乳糖,产生乳酸,使pH下降,因而产生红色菌落,而当外源片段插入后,失去α互补能力,因而不产生β半乳糖苷酶,无法分解培养基中的乳糖,菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α互补现象筛选。注意DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关,连接平齐末端,必须加大酶量,一般使用连接粘性末端酶量的倍。

40.构建基因组文库的基因步骤1纯化全细胞dna.2部分限制性酶切的到适当大小的片段3插入到合适的载体上构建重组dna分子4重组dna分子经转化进入宿主细胞5铺平板获得克隆。答案：(1)小于(2)限制酶反转录(3)pcr技术基因表达载体的构建启动子、终止子、目的基因(4)农杆菌转化法dna分子杂交24．(1)预期蛋白质的功能(2)基因化学(3)感受态细胞转化(4)农杆菌转化法25．(1)dna聚合126(2)①繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少②保证目的基因和载体定向连接(或防止目的基因和载体在酶切后产生的黏性末端发生任意连接)③标记基因(3)合成的核苷酸单链较长，产生缺失碱基的现象。方法利用pcr技术扩增hrsv兰州株的融合蛋白基因片段，克隆于原核表达载体pet-42b（＋），转化大肠杆菌（rosetta），经iptg诱导表达，镍离子亲和层析柱纯化，sds-page和western-blot分析重组蛋白的表达及其反应原性。

利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般kb以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。

本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。第七章RFLP和RAPD技术DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失,导致酶切片段大小发生了变化,这种变化可以通过特定探针杂交进行检测,从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性）,多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆,位于染色体的不同位点,从而可以作为一种分子标记(Mark),构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时,表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小,即表示目标基因与分子标记之间的距离,从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上,可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后,所切的片段类型不一样,因此,限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。

常用的限制性内切酶一般是HindⅢ,BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多,则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA,随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短,但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。

一个引物的dna合成产物作为另一个引物的模板，进行dna变性、引物退 火，dna聚合酶管伸反应的多次重复性循环，可使引物规定区域的拷贝数成指数增 加。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等，引物是一段短的单链rna或dna片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链，另一个链是反着一段一段复制的，这个是正链。boc-l-丝氨酸生物过程技术：基因表达和分离纯化技术、dna重组及转基因技术、酶&蛋白质工程技术、细胞和原生质融合技术、酶和细胞固定化技术、动植物细胞大规模培养技术、动物胚胎工程技术、微生物发酵技术、生物反应工程、生物分离工程技术、下游技术、发酵培养技术等分析技术、生物分析、产品过程分析、高速筛选、生化分析、低分子自然产物、基因测序、生物芯片等。

引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：()引物长度约为bp,太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。()引物中GC含量通常为,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝(GC)(AT)()四种碱基应随机分布,在'端不存在连续个G或C,因这样易导致错误引发。()引物'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。()在引物内,尤其在'端应不存在二级结构。()两引物之间尤其在'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。两引物间最好不存在个连续碱基的同源性或互补性。()引物'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等通常应在'端限制酶位点外再加个保护碱基。()引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。()简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

一般PCR反应中的引物终浓度为μmolL。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在cm光程比色杯中,nm下,引物浓度可按下式计算：XmolL＝ODA()C()G()T()X:引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中种不同碱基个数。种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH将pH调至,并用分光光度计测定其准确浓度dNTP原液可配成mmolL并分装,℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为μmolL。理论上种dNTP各μmolL,足以在μl反应中合成μg的DNA。当dNTP终浓度大于mmolL时可抑制TaqDNA聚合酶的活性种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。Mg：Mg浓度对TaqDNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg浓度范围为mmolL对于一种新的PCR反应,可以用mmolL的递增浓度的Mg进行预备实验,选出最适的Mg浓度。在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg离子浓度的物质,以保证最适Mg浓度。

17.dna操作酶根据其催化反应的类型分五大类1核酸酶：切开、切除或降解核酸2连接酶：将核酸分子连接起来的酶3聚合酶：复制核酸分子的酶4修饰酶：去除或添加化学集团的酶5拓扑异构酶：向共价闭合环状dna中引入或消除超螺旋的酶。除启动子外，往往还有一些调控转录的其他因子，如调节基因和操纵基因原核生物基因转录终止之前同样有一段回文序列结构，称为终止子第一个作为重组dna载体的质粒，它的特殊的碱基排列顺序能够阻碍rna聚合酶的移动，并使其从dna模板链上脱离下来。 借助催化剂分子设计， 研制新型的活性有机金属配合物催 化剂体系，催化烯烃和炔烃单体定向配位可控聚合，合成 出高分子量、 立构规整性高特殊性能的聚烯烃和聚炔烃高 分子材料，展开相关的理论基础研究，聚合物结构与性能 间关系的研究。

()加入mmolL的EDTA螯合Mg。()℃加热min目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。反应缓冲液：反应缓冲液一般含mmolLTrisCl(℃下pH),mmolLKCl和适当浓度的MgTrisCl在℃时pH为,但在实际PCR反应中,pH为mmolL的KCl有利于引物的退火另外,反应液可加入mmolL的二硫苏糖醇(DDT)或μgml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T噬菌体的基因蛋白则对扩增较长的DNA片段有利各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。二、PCR反应参数变性：在第一轮循环前,在℃下变性min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入TaqDNA聚合酶(hotstart),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量一般变性温度与时间为℃min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列,可适当提高变性温度但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成,引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低℃。一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时,应提高退火温度。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用℃和℃)完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为℃℃,min。延伸：延伸反应通常为℃,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度℃实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从℃℃延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度在一般反应体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。循环次数：当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言轮循环已经足够。