如何阅读质粒图谱

载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。

复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。

抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+

多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段

P/E 启动子/增强子

Terms 终止信号

加poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用

第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）

实施例11稳定地共表达t1r1/t1r3或t1r2/t1r3的细胞系的产生通过将分别包含ht1r1或ht1r2表达构建体(质粒sav2485用于t1r1，质粒sav2486用于t1r2)和ht1r3(质粒sxv550用于t1r3)的线性化的由peak10衍生而来(edge biosystems)的载体和由pcdna3.1/zeo衍生而来(invitrogen)的载体转染到gα15表达细胞系中，产生稳定地共表达人类t1r2/t1r3或人类t1r1/t1r3的人类细胞系。bait 质粒转化酵母与表达检测 第一步：制备感受态酵母细胞。“宿主细胞”是指包含表达载体并支持该表达载体复制或表达的细胞。

第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。

Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。

tetr可以阻止四环素进入细胞。

camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活

hygr 使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。

第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。

启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号

含有复杂转录单位的主要是一些编码组织和发育特异性蛋白质的基因，它们除了含有数量不等的内含子以外，其初级转录产物能通过多种不同方式加工成两个或两个以上的mrna。由rna聚合酶ii负责转录的ii类基因包括所有蛋白质编码基因和部分snrna基因，后者的启动子结构与iii类基因启动子中的第三种类型相似，编码蛋白质的ii类基因启动子在结构上有共同的保守序列（转录起始位点、tata框、caat框、增强子）。原核生物启动子：\x0d在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和rna聚合酶从dna链上脱落.\x0d例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的gc丰富区,其后紧跟at丰富区,这就是转录终止子的结构.\x0d终止子有强、弱之分,强终止子含有反向重复顺序,可形成茎环结构,其后面为polyt结构,这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止.\x0d而弱终止子尽管也有反向重复序列,但无polyt结构,需要有终止蛋白参与才能使转录终止.\x0d典型转录终止子的特征：茎环结构,富含gc。

增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。

核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体

转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个aataaa的保守序列，此位点down－stream有一段gt或t富丰区，这2部分共同构成poly（a）加尾信号。我个人建议，如果您的目的基因的同源基因的核酸序列比较保守的话，不需要用它们设计引物的。34.ti质粒的结构及其各区段的功能1.t－dna区段：携带一些“致瘤”基因，t-dna转移至植物细胞内，与植物细胞基因组dna整合2.vir区：含有一些控制t-dna转移的基因，t-dna细胞内的转移及整合必须由vir区基因表达产物的协助才能完成，而vir区dna本身并不转移到植物细胞内3.左边界序列和右边界序列：t-dna两端边界处各有一段25bp高度保守正向重复序列，lb和rb序列对t-dna的转移和整合起关键作用。

1.是唯一可以进行长期研究的方法.双链rna只能短暂抑制哺乳动物细胞的基因表达,而具有发卡结构的双链rna能够增加阻断基因表达的时间.在小鼠畸胎瘤细胞,胚胎干细胞,c2c12细胞中,用长链具有发卡结构的双链rna有效的阻断了报告基因的表达,在稳定表达具有发卡结构的双链rna的细胞株中,报告基因的表达被长期的阻断了.带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久.即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选,也有助于富集带质粒的细胞.这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题.。答：客户需要提供：(1)含有目标基因的质粒(包括测序图谱)，或目的基因的名称及序列。36.用ti质粒在植物细胞内引入新的基因策略1.双元载体策略：将ti质粒上的t-dna区段置于一个小质粒b上，其它区段置于一个大质粒a上，当质粒a与b共存于同一根瘤农杆菌细胞内时，它们互为补充质粒和载体，a携带基因编码的蛋白质让b携带的t-dna转入并整合到植物染色体dna上2.共整合策略：改造大肠杆菌质粒，使其携带部分t-dna区段，目的基因插入后，当该质粒与ti质粒共存在同一根瘤农杆菌内时质粒和载体，两者碱会发生同源重组，使得该质粒整合进ti质粒的t-dna区段，感染植物后，目的基因就和t-dna一起整合到植物染色体上。