新型环二核苷酸受体及其激动剂或抑制剂筛选的方法和试剂盒与流程(3)

步骤2，采用光度计对加入待筛选药物后报告基因表达进行实时动态监测。

科学家研究发现,萤火虫的发光器位于腹部.这个发光器由发光层、透明层和反射层三部分组成.发光层拥有几千个发光细胞,它们都含有荧光素和荧光酶两种物质.在荧光酶的作用下,荧光素在细胞内水分的参与下,与氧化合便发出荧光.萤火虫的发光,实质上是把化学能转变成光能的过程.。c.酶活计算 以微晶纤维素悬浮液为底物，酶活单位(iu)定义为每min每ml酶液作用于底物生成的葡萄糖的量(μmol)。酶联荧光免疫体系中的关键部分在于生物活性物质的固定和荧光底物的选择，本文试发展几种新的荧光底物用于酶联荧光免疫体系的检测。

科学家研究发现,萤火虫的发光器位于腹部.这个发光器由发光层、透明层和反射层三部分组成.发光层拥有几千个发光细胞,它们都含有荧光素和荧光酶两种物质.在荧光酶的作用下,荧光素在细胞内水分的参与下,与氧化合便发出荧光.萤火虫的发光,实质上是把化学能转变成光能的过程.。它们都含有荧光素和荧光酶，在荧光酶的作用下，在细胞内水分的参与下，荧光素与氧化合便发光荧光，萤火虫就是这样发光的，科学家根据这一特点，发明了人工冷光，作为安全照明用。因此，高通量筛选、虚拟筛选、基于结构的药物设计、以及先导化合物的优化成为小分子药物发现的常见技术。

(3)实验中用35s标记一定量的氨基酸，来培养某哺乳动物的乳腺细胞，测得内质网、核糖体、高尔基体上放射性强度的变化曲线如图甲所示，以及在此过程中高尔基体、细胞膜、内质网膜面积的变化如图乙所示。（山西）几千年来中国的厨艺最讲究的就是“火候”二字．现在市面上流行如图所示的新型电饭锅，采用了“聪明火”技术，电脑智能控温、控压，智能化控制食物在不同时间段的温度，以得到最佳的口感和营养，其简化电路如图甲所示．r1和r2均为电热丝，s是自动控制开关．把电饭锅接入220v的电路中，用电饭锅的“聪明火”煮米饭，电饭锅工作时的电流随时间变化的图像如图乙所示．。再点击d1单元格下拉按钮，在弹出菜单中选择“数字筛选→小于或等于”命令，如图3所示，打开“自定义自动筛选方式”对话框，在“小于或等于”后的输入框中输入数字“20”，如图4所示。

实施例六 稳定细胞株在筛选STING亚型M抑制剂中的应用

本发明所公开的是一种基于本发明所建立的报告细胞系统来高通量筛选STING亚型M的抑制剂的方法。这个发明是基于细胞外抗STING蛋白C端的抗体(Abcam，产品ab189430)可以阻断人STING亚型M和小鼠STING亚型M对于外源性配体的识别。

步骤1，把上述试剂盒所提供的人STING亚型M和小鼠STING亚型M的稳定细胞系铺入96孔板。

将来自一个克隆的细胞(指定为s-9细胞)接种到384孔板(约50,000个细胞/孔)的培养基中，该培养基含有dmem低葡萄糖(invitrogen，carlsbad，ca)、10％经透析的胎牛血清(invitrogen，carlsbad，ca)、100单位/毫升的青霉素g和100μg/ml链霉素(invitrogen，carlsbad，ca)(li等，请见上文)，还见国际专利申请wo 03/001876 a2)。如小鼠nih-3t3细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前1天接种细胞，接种密度为2×10个/cm，用含10%胎牛血清的dmem培养基，37℃、5% co2培养，待细胞占50%-70%瓶底面积时，用于转染试验。小凹和小凹蛋白参与囊泡运输、细胞内外钙稳态、胆固醇稳态和内吞作用[5,11]. 此外,它们还在信号转导、细胞增殖和肿瘤进展中发挥重要作用[12-13]. 从功能上看,小凹和小凹蛋白对于区室化和各类信号分子(包括受体和非受体酪氨酸激酶,血管内皮型一氧化氮合酶,和小 gtp 酶等)的浓度以及干扰下游许多蛋白质和癌基因蛋白(如 c-src、h-ras 和增殖作用蛋白激酶等)的活性和信号转导至关重要[5-6,11]. 最近的研究也表明,小凹蛋白可以独立发挥他们的作用,无论是在有小凹的细胞(如心肌细胞和成纤维细胞),还是那些缺乏小凹的细胞(如神经元和白细胞)中发挥作用[14]. 因此,这些发现表明,小凹蛋白功能的实现不一定依赖于小凹的存在,这些蛋白质可能发挥与他们相关的小凹以外的和其他相关的生物学作用。

ht1080（人纤维肉瘤细胞）中分别加入培养基（-）和 sev（+）， 然后收集细胞用对照抗体（igg）和 anti-pcbp2 抗体来富集蛋白，再用 anti-mavs 的抗体。接区域的 pcbp2） ， 24 小时后收集细胞， 用对照抗体 igg 和 anti-flag 来富集蛋白， 用 anti-ha 来检测 mavs 和 aip4 的相互作用，同时显示全细胞裂解液中这种标签蛋白表达（j）。24 小时后收集细胞，用对照抗体 igg 和 anti-flag 来富集蛋白，用 anti-ha 来检测 pcbp2 和 aip4 的相互作用，同时显示全细胞裂解液中各种标签蛋白表达（e）。

步骤2，采用光度计对加入待筛选药物后报告基因表达进行实时动态监测。

由于STING亚型M激活后会进一步激活一型干扰素的启动子，本发明在一型干扰素的启动子下游加入了荧光素报告基因。STING亚型M的配体c-di-AMP会导致荧光素酶报告基因表达的上升以及一型干扰素本身表达的上升。如果所加药物可以抑制一型干扰素的启动子的激活以及一型干扰素本身的表达，表明该药物可以抑制人STING亚型M和小鼠STING亚型M的功能。

在加入c-di-AMP 16小时后，可以直接通过ELISA检测上清中一型干扰素的含量或细胞内一型干扰素的含量，又或者吸去上清。每个孔加入100μl的细胞裂解液并进行震荡20分钟。将20微升细胞裂解液和80μl荧光素酶底物混合，使用光度计进行测量荧光素酶底物所发出的荧光强度。

步骤3，利用该系统可以准确高效筛选抑制荧光素酶表达的化合物。所筛选出的药物即为STING亚型M的抑制剂。

如图4所示，这个方法与传统的针对细胞内环二核苷酸的受体STING相比，省去了把报告细胞系打孔或者把药物包裹在脂质体中的步骤，大大简化了药物筛选的流程并扩大了可筛选药物的范围(例如药物不需要能被脂质体所包裹)。

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