新型环二核苷酸受体及其激动剂或抑制剂筛选的方法和试剂盒与流程(2)

自身抗体：抗肾上腺抗体、胰岛细胞抗体、谷氨酸脱羧酶抗体、甲状腺球蛋白抗体、甲状腺过氧化物酶抗体、抗核抗体、抗壁细胞抗体、肝肾微粒体抗体、平滑肌抗体、线粒体抗体、乙酰胆碱受体抗体和抗rnp、sm、ssa、ssb抗体均阴性。 第二章特异性识别masp2-c单克隆抗体制备和鉴定 以纯化的重组masp2-c蛋白为抗原，将其与等体积佐剂充分乳化，免疫6只balb/c小鼠，免疫3次后以间接elisa法测血清抗体效价达 1.0×105以上时，即可取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(ns-1)融合，按常规方法制备杂交瘤。对脾ts细胞功能的影响： 采用超适量srbc免疫（soi）诱导ts细胞法观察到，供体小鼠脾细胞中ts细胞可使正常免疫小鼠的pfc数抑制63%，表明soi法可以诱导出对抗体生成细胞产生显著抑制作用的ts细胞。

干扰素首先作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生化过程，激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。人体肠道中的有益菌有刺激免疫系统的作用，但如果在日常生活中食品所含抗生素或是类固醇的含量太高的话，都会导致肠道内的有益菌降低，因而无法有效地刺激免疫细胞中辅助型t细胞1（th1)的生成，而这些辅助型t细胞1的生成与辅助型t细胞2（th2)相关过敏疾病的发生有着密切联系。而β-干扰素则有4个亚型，至于γ-干扰素只有一个亚型。

图4显示使用本发明高通量筛选药物的方式，并和传统方式进行对比。

具体实施方式

实施例一 人和小鼠STING亚型M基因表达质粒的构建和鉴定以及人和小鼠STING亚型M基因表达量的鉴定。

我们通过高通量RNA测序的方法发现Tmem173除了编码传统的STING亚型1之外，还编码其他的亚型，我们命名为STING亚型M。为了确认人和小鼠STING亚型M的存在，我们设计了引物特异性的扩增人和小鼠STING亚型M。简言之，使用RNA提取试剂从野生型小鼠脾细胞或人PBMC制备总RNA，然后用逆转录试剂盒(Invitrogen，18080-051)，遵循制造商的说明把RNA逆转录为cDNA。扩增人和小鼠STING亚型M基因的引物如下所示：

对于小鼠的STING亚型M只需使用引物mIsoform M-F/R在小鼠脾细胞中进行1轮PCR扩增。对于人的亚型M需进行巢式PCR以扩增特异性序列。人的PBMCs cDNA作为具有外引物(hIsoform M-F-1和hIsoforms M-commonR)的第一轮PCR模板。再将第一轮的PCR产物作为模板进行第二轮PCR(使用引物hIsoforms M-F-2和hIsoforms M-commonR)。所得到的人和小鼠的STING亚型M的特异性的序列和全转录组测序所得到的人和小鼠的STING亚型M完全一致。因此我们确认了人和小鼠STING亚型M在人和小鼠的原代免疫细胞中的存在。

可以采用在细胞中稳定表达或瞬时表达的表达盒、载体或病毒(例如附加型表达系统)来表达核酸。构建共表达o型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,fmdv) 衣壳蛋白前体p12a和蛋白酶3c的重组杆状病毒,为进一步研究fmdv 空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础.从质粒t-op1中扩增出编码o型fmdv衣壳蛋白前体的p12a 基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pfastdual-3c的ph启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pd-p12a3c.通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒b-p12a3c,转染sf9细胞,获得表达o型fmdv衣壳蛋白的重组杆状病毒.重组杆状病毒经增殖并感染sf9细胞后,通过双抗体夹心elisa方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表达.结果表明,表达产物能被o型fmdv阳性血清识别,具有一定的反应原性,表明重组杆状病毒构建成功,该研究为o型fmdv空衣壳的体外组装及基因工程亚单位疫苗的研究提供了前期材料.。利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计合成引物,从菊苣叶绿体基因组中扩增包括rps7-rps12-trnv-16s-rdna基因在内的一段序列(genbank登录号为gq199478),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段.以叶绿体基因强启动子prrn驱动选择标记基因aada及报告基因gfp构建多顺反子表达盒prrn-aada-gfp-psba-3′,然后将表达盒克隆进菊苣叶绿体同源片段中,获得菊苣叶绿体定点整合表达载体pjag,酶切分析证明所构建的载体符合预期设计.该载体的构建为建立菊苣的叶绿体转化体系奠定基础,为进一步通过叶绿体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良,或以菊苣叶绿体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台.。

为了构建人和小鼠STING亚型M的慢病毒表达载体，以上表达人STING亚型M和小鼠STING亚型M的表达载体通过含有Sgf I限制酶切割位点的正向引物和含有MluI限制酶切割位点的反向引物进行PCR扩增(94℃5分钟，然后循环：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃ 3分钟，在40个循环后，然后在72℃最后延伸10分钟。)。目标条带使用QuickClean II胶回收试剂盒(金斯瑞公司，产品L00418)并使用T4DNA连接酶将目标片段插入带有SgfI/Mlu I酶切位点的pLenti载体(Origene，产品RC208418L2V)。然后将慢病毒载体纯化并测序。

实施例二 稳定转染细胞株的构建(以HEK293T细胞为例)

首先使用Lenti-vpak包装盒(Origene，产品TR30022)将含有以上人STING亚型M和小鼠STING亚型M的慢病毒表达载体进行包装并产生慢病毒颗粒。

将HEK293T细胞保持在37℃培养，并培养在含有10％(v/v)胎牛血清以及10单位/ml青霉素-链霉素溶液的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)完全培养液当中。将含有慢病毒颗粒的细胞上清加入HEK293T培养液中并进行离心感染。转染48h后，离心HEK293T细胞重悬于含有300μg/ml G418的完全生长培养液中。两周后出现耐药菌落。将GFP+细胞在FACSAria II细胞分选仪(BD生物科学)进行分选。所取得的GFP+细胞在用有限稀释法进行单克隆细胞的挑选。

在取得稳定表达人和小鼠STING亚型M的细胞系后，将稳定表达重组蛋白的HEK293T细胞系接种在24孔培养板中(0.2x106个细胞/孔)过夜。然后将一型干扰素的报告基因进行瞬时转染。具体来说在150μl无血清DMEM培养基中稀释3μg带有一型干扰素的启动子序列的报告基因质粒并与含有9μl TurboFectin Transfection Reagent(美国OriGene公司)的150μl无血清DMEM培养基混合。室温孵育20min。将稳定细胞系的上清吸去，并将合并后的DNA-脂质体复合物溶液中按照每孔300μl加入稳定细胞系。将24孔板置于二氧化碳培养箱内37℃培养。转染6小时后换液，用完全生长培养基代替无血清培养基。24小时后，吸去上清。一组加入含有c-di-AMP(终浓度为30μM，(InvivoGen，产品vac-cda)完全培养基。另一组只加完全培养基。在配体刺激后16小时使用加入荧光素酶的底物测定荧光素酶活性。结果发现：加入c-di-AMP的组比只对照转染组的荧光素酶活性显著升高，证明人和小鼠STING亚型M可以成功的表达并行使其功能。核苷酸合成抑制剂

实施例三 特异性鉴定及检测人和小鼠STING亚型M的方法及试剂盒。

在mRNA的水平上检测及鉴定人和小鼠STING亚型M的方法：使用上述试剂盒提取目标组织或细RNA，并使用试剂盒中的RT酶把RNA逆转录为cDNA。对于小鼠的STING亚型M只需使用引物mIsoform M-F/R进行1轮PCR扩增。对于人的亚型M需进行巢式PCR以扩增特异性序列。人的cDNA作为具有外引物(hIsoform M-F-1和hIsoforms M-commonR)的第一轮PCR模板。再将第一轮的PCR产物作为模板进行第二轮PCR(使用引物hIsoforms M-F-2和hIsoforms M-commonR)。在琼脂糖凝胶电泳上可看到，小鼠STING亚型1和M的条带(经测序验证)(图1)。根据条带的亮度和管家基因的亮度的比较可进行相对定量。同样的引物可用于二代靶向测序，例如Ion Torrent或者Illumina平台的测序，可根据reads的量进行精确定量。

使用常规的蛋白质印迹方法在蛋白质水平上检测及鉴定人和小鼠STING亚型M。简要来说，对于目标组织或细胞制备加入试剂盒所提供的蛋白提取溶液制备蛋白提取物(可使用组织高速匀浆仪，研钵和研磨匀浆器以及超声破碎等方法)。在煮沸5分钟后，进行SDS-PAGE实验并使用半干法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad，产品162-0115)上。使用含有5％(w/v)BSA的1X TBST在室温下2小时对硝酸纤维素膜进行封闭。然后将硝酸纤维素膜转移至含有一抗(Cell Signaling，产品13647，1∶1000稀释)以及5％(w/v)BSA的1×TBST在4℃下在摇摆孵育过夜。在含有5％(w/v)BSA的1xTBST的溶液中清洗3次，每次5分钟。然后将膜与含有二抗(抗兔-HRP或抗兔-AP抗体，1∶5000稀释)以及5％(w/v)BSA的1×TBST室温下孵育2小时。然后在含有5％(w/v)BSA的1xTBST的溶液中清洗3次，每次5分钟。之后进行显色和拍照。如图2所示，通过目标蛋白的条带对STING亚型1和M蛋白表达水平进行半定量计算。

实施例四 人和小鼠STING亚型M是感受细胞外环二核苷酸的受体并激活一型干扰素生成

科学家研究发现,萤火虫的发光器位于腹部.这个发光器由发光层、透明层和反射层三部分组成.发光层拥有几千个发光细胞,它们都含有荧光素和荧光酶两种物质.在荧光酶的作用下,荧光素在细胞内水分的参与下,与氧化合便发出荧光.萤火虫的发光,实质上是把化学能转变成光能的过程.。发光层拥有几千个发光细胞，它们都含有荧光素和荧光酶两种物质。gensat储存了小鼠大脑的组织切片图像，这些组织切片中都含有各种标签，例如增强的绿色荧光蛋白标签等，这样可以根据标签的荧光强度来判断基因的表达量。

实施例五 稳定细胞株在筛选人STING亚型M和小鼠STING亚型M激活剂中的应用

步骤1，把上述试剂盒提供的稳定表达STING亚型M以及一型干扰素的报告基因的报告细胞系铺入96孔板，并加入待筛选药物。

对于贴壁生长的报告细胞系(例如HEK293T细胞系)需预先经胰蛋白酶/EDTA在37℃处理10分钟，加入有10％胎牛血清的RPMI1640中和胰蛋白酶。对于悬浮的报告细胞系(例如THP-1细胞系)，可直接进行下一步的离心步骤。在500g离心5分钟后，将细胞重悬在10％胎牛血清、青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL的DMEM完全培养液中，细胞密度为1×105/ml。将细胞铺于96孔板中(200微升每孔)。在37℃、含5％CO2培养孵箱培养，备用。16小时后，吸去上清，加入200μl含有待筛选药物的DMEM完全培养液中.同时设立阳性对照组(30μM的c-di-AMP，InvivoGen，产品vac-cda)及阴性对照组(只加培养液，不加任何药物)。

一般用弗氏压碎法或超声波处理，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因.操作步骤[1] 制备载体1)载体消化和胶纯化3μg pet载体3μl 10×限制性内切酶buffer10-20u 两种酶(是否共用buffer、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/，在细菌培养基中加入iptg来启动表达。基因芯片: 辛华雯等研究小檗碱对大鼠肝脏基因表达谱的影响，检测了4 096个基因，盐酸小檗碱组差异表达基因236个，与代谢相关的差异表达基因共32个，其中表达上调的代谢相关基因8个，包括大鼠环核苷酸磷酸二酯酶、异柠檬酸脱氢酶3、心肌黄酶和葡萄糖_l5-磷酸酶等。作为人体1号辅酶，线粒体素还能够激活其他酶和辅酶的活性，联合修复受损病变的线粒体基因。