制备稳定的锌胰岛素类似物结晶的方法(2)

实施例1在不锈钢筒中用纯化水(260.6l)和冰乙酸(19.44l)将846.5gLysB28ProB29-hI(碱基)的116l乙酸缓冲液稀释至最终乙酸浓度为1N，在276nm处的吸光度为2.25。以2ml/l的比例(总共792ml)将液化的苯酚加到上述溶液中，生成溶液的pH确认低于pH3。加入24l氢氧化铵使溶液的pH调节至6.01，然后温热至22℃。温热之后，加入5.35l氯化锌溶液(2％W/V水溶液)。再次确认溶液的pH在所要求的范围(5.9～6.1)内，将该溶液搅动12小时。溶液冷却至8℃，停止搅动，于2～8℃允许结晶沉降18小时。结晶沉降之后，倾出370l上清液，余下的上清液和结晶层转移至较小的不锈钢筒内再次进行沉降，并倾出部分上清液清洗原先用的不锈钢圆筒。沉降14小时之后，倾出61l上清液，佘下约9l结晶层和上清液。

在上述容器中将结晶搅成泥浆状物并离心在6个1l离心瓶中，用DPR6000以4000rpm(约4000×G)离心45分钟。为了将全部结晶泥浆状物离心在6个离心瓶中需要装料2次。倾去上清液。每一离心瓶中的结晶(每瓶约250ml)用500ml纯化水搅成泥浆状，并以4000rpm离心45分钟。然后离心瓶中的结晶再用约500ml冷却(2～8℃)的无水乙醇(SD No.3A)搅成泥浆状并再次以4000rpm离心15分钟。倾去上述乙醇上清液，再用乙醇重复2次。在真空下将乙醇洗涤的结晶(湿重1.9kg)干燥。

实施例2制备约2g/l的约LysB28ProB29-hI溶液，最终乙酸浓度为1M(在280nm处测定光密度)。向上述溶液中加入液化苯酚(每升该溶液用3.3ml)，接着用浓氢氧化铵调节pH至5.9～6.2，再加入氯化锌(2％W/V或20％W/V溶液)，最终浓度为每克LysB28ProB29-hI用40～160mg氯化锌。使生成的结晶沉降，用倾析法移出母液，随后离心。用水连续搅成泥浆状并离心，最后在真空干燥之前用无水乙醇搅成泥浆状并离心。通过向母液中加入锌得到另外的结晶，其极限值为每克母液有LysB28ProB29-hI 160mg。

实施例3将LysB28ProB29-人工胰岛素(222mg)溶于100ml Milli-Q水中。用高效液相色谱分析测定，每毫升上述溶液含有2.0mg LysB28ProB29-hI。用10％盐酸将溶液的pH调节至约3，溶液变清。取4份等分试样，每份5ml，并加入冰乙酸使乙酸浓度为1N，确认pH在3.5以下。在每份样品中依次加入10μl液化苯酚和6μl氯化锌溶液(20％W/V水溶液)。加入浓氢氧化铵，或者加入氢氧化钠(10％W/V溶液)或氢氧化钾(10％W/V溶液)，调节pH至6.0。将上述溶液搅拌约15分钟，随后于室温下复盖静置。约2小时之后，在所有3份溶液中均有很好的菱形结晶生成，并且在用氢氧化钾调节pH的溶液中结晶形成最迅速。

实施例4将约42mg LysB28ProB29-hI溶于各含有1.2ml冰乙酸的两份20ml Milli-Q水中。44μl液化苯酚加到第一份样品中，34μl液化苯酚加到第二份样品中。加入浓氢氧化铵使2份样品的pH调节至6.0，随后加入45μl氯化锌溶液(20％W/V水溶液)。将溶液搅拌约5分钟，并使其于室温下复盖静置。约24小时后得到很好的菱形结晶。

实施例5将LysB28ProB29-人工胰岛素(222mg)溶于100ml Milli-Q水中，用高效液相色谱分析测定，每毫升溶液含有2.0mg LysB28ProB29-hI。用10％盐酸调节pH至约3.0，溶液变清。取4份等分试样，每份5ml，并加入泳乙酸使乙酸浓度为1N，确认pH在3.5以下。向各等分试样中加入间甲苯酚(12μl)、苯酚(10μl)、间苯二酚(每毫升水溶液含100mg，用2.1μl)或羟基苯甲酸甲酯(每毫升水溶液含10mg，用1.6ml)，得到具有相同的肽与酚衍生物摩尔比例的结晶溶液。向每份样品中加入6μl氯化锌溶液(20％W/V水溶液)，用浓氢氧化铵调节pH至6.0。溶液搅拌约15分钟，然后于室温下将其复盖静置。人工合成结晶牛胰岛素化学式约24小时之后在含有苯酚的溶液中得到很好的菱形结晶。含有羟基苯甲酸甲酯的溶液生成一些不好的平面结晶。在上述条件下含有间甲苯酚和间苯二酚的溶液未产生结晶。

用1/10量间苯二酚并用氢氧化钠(10％W/V溶液)进行调节，按同样的方法处理，得到很好的菱形结晶。该实施例表明，应用酚衍生物，按常规的最佳条件可以得到很好的结晶。

实施例6将LysB28ProB29-hI(222mg)溶于100ml Milli-Q水中，用高效液相色谱法分析测定，每毫升该溶液含有2.0mg LysB28ProB29-hI。用10％盐酸调节pH至约3.0，溶液变清。取1份5ml试样，加入泳乙酸，使乙酸浓度为0.25N，确认pH低于3.5。向该样品中加入20μl氯化锌溶液(2％W/V水溶液)。加入浓氢氧化铵调节pH至6.0。将溶液搅拌约15分钟，并使其于室温下复盖静置。约24小时之后，在溶液中无结晶生成，但在容器的底部有非结晶状沉淀沉集。

取另一5ml试样作为对照，并按实施例1所述方法用氢氧化铵进行处理。得到很好的LysB28ProB29-hI菱形结晶。而当人工胰岛素(2.3mg/ml，1N乙酸)按实施例1所述条件用氢氧化铵处理时，在7天内无结晶生成。

上述实验表明，用于使生物合成的人工胰岛素结晶的常规条件不适用于使LysB28ProB29-人工胰岛素结晶，并且同样，使LysB28ProB29-hI结晶所述的结晶条件也不能使人工胰岛素结晶。

实施例7按实施例1类似的方法实施结晶过程，但用1N柠檬酸代替1N乙酸。结晶过程中产生很好的LysB28ProB29-hI结晶。

权利要求

1.制备结晶状LysB28ProB29-人工胰岛素的方法，该方法包括使LysB28ProB29-人工胰岛素从含有LysB28ProB29-人工胰岛素、锌、至少0.3N选自乙酸、柠檬酸或甘氨酸以及酚衍生物的有机酸的溶液中在约pH5.5～6.5结晶。

2.权利要求1的方法，其中LysB28ProB29-人工胰岛素的浓度为约1.8～2.5g/l；酚衍生物为苯酚；锌的浓度为约每克LysB28ProB29-人工胰岛素40～400mg。

3.权利要求2的方法，其中苯酚的浓度为按体积计约0.15～0.25％。

4.权利要求3的方法，其中pH为约5.9～6.2。

5.制备结晶状LysB28ProB29-人工胰岛素的方法，该方法包括(a)将苯酚按0.15～0.25％(以最终体积计)加到每升为1.8～2.5g LysB28ProB29-hI的约1N乙酸的溶液中；(b)用氢氧化铵调节pH至约5.9～6.2；(c)加入锌盐溶液，最终浓度为每克LysB28ProB29-hI约40～400mg锌。

全文摘要

本发明公开了制备结晶状胰岛素类似物的方法。该方法可用于纯化和制备Lys

文档编号C07K1/00GK1128271SQ9510655

公开日1996年8月7日 申请日期1995年6月14日 优先权日1994年6月16日

发明者J·C·贝克, N·D·卡特, B·H·弗兰克 申请人:伊莱利利公司