制备稳定的锌胰岛素类似物结晶的方法

专利名称：制备稳定的锌胰岛素类似物结晶的方法

技术领域：

本发明是关于人工胰岛素的单体类似物。更具体地说，本发明涉及制备一结晶状胰岛素类似物的方法。该方法可用于LysB28ProB29-人工胰岛素的纯化和制备。LysB28ProB29-人工胰岛素可用于治疗糖尿病。

由于廿世纪20年代胰岛素的推广，糖尿病治疗的改进取得了不断的进展。在胰岛素纯度和有效性方面取得了主要的进展。还研究了不同时间作用的各种配方。尽管取得了这些进展，但是皮下注射治疗仍然未能给患者提供方便的控制方法和标准的糖血控制。在患者的使用期限，从正常糖血水平的经常偏离额定值会导致高血糖、低血糖和长期的并发症(包括视网胰病、神经病、肾病以及微血管病和大血管病)。

为了避免引起急剧的糖血水平变化，糖尿病人经常实施多次注射治疗，因此需每餐注射胰岛素。但是这种治疗方法不是优选的。在注射市场上购买的最迅速作用的胰岛素之后达到峰值太迟，并且拖得时间太长以至于不能最优的控制葡萄糖水平。近来人们做了相当大的努力以便创造改变皮下吸收过程动力学的胰岛素配方和胰岛素类似物配方。

因药用植物的活性物中含有生物碱，也就是我们俗语中所说的“是药三分毒”的“毒”，若超浓度使用会引起短时过敏，浓度太低又无功效，因此，调配单方原液需经严格按配方操作。beautymed其独特配方使用的是药用级别的活性成份，注重成份的浓度和精纯度为保证皮肤使用的安全性，所有成份的提取都通过了欧洲立法。卡波姆941/药用卡波姆941/卡波姆940药用丙二醇165kg/桶药用级/出口丙二醇、药用丙二醇大包装富马酸 药用级 500g/袋 25kg/袋 500g起售（资质齐全，有批件）巴斯夫泊洛沙姆188/泊洛沙姆407药用明胶药用/180冻力明胶/药用明胶/软胶囊制造明胶。

本发明提供新的制备上述单体类似物LysB28ProB29-人工胰岛素(LysB28ProB29-hI)结晶的方法。LysB28ProB29-hI已在欧洲专利公布号383472中公开。但是该专利未公开制备结晶状LysB28ProB29-hI大批生产可行的方法。

权利要求1用氯化钴溶液制备结晶氯化钴过程中蒸汽利用的工艺方法，其特征是首先将氯化钴溶液从蒸发前液储罐泵入到蒸发前液高位槽，用第一换热器内的蒸汽对蒸发前液高位槽内的氯化钴溶液进行预热至50—70℃，然后将预热后的氯化钴溶液放入蒸发釜内，通入蒸汽对蒸发釜内的氯化钴溶液加温，蒸发釜真空度为-0.06—0mpa，温度为80—90℃，蒸发结束后将余下的氯化钴溶液放入至结晶釜内进行结晶流程。用氯化钴溶液制备结晶氯化钴过程中蒸汽利用的工艺方法，其特征是首先将氯化钴溶液 从蒸发前液储罐泵入到蒸发前液高位槽，用第一换热器内的蒸汽对蒸发前液高位槽内的氯化 钴溶液进行预热至50 — 7(tc，然后将预热后的氯化钴溶液放入蒸发釜内，通入蒸汽对蒸发釜 内的氯化钴溶液加温，蒸发釜真空度为-0.06 — 0mpa，温度为80 — 9(tc，蒸发结束后将余下 的氯化钴溶液放入至结晶釜内进行结晶流程。延胡索的茎块中富含了十几种生物碱在里面，有紫堇碱、dl-四氢掌叶防己碱、原阿片碱、l-四氢黄连碱、dl、四氢黄连碱、紫堇鳞氢碱、b-高白屈菜碱、l-四氢非洲防己碱、黄连碱、紫堇达明碱、去氢紫堇达明碱、去氢紫堇碱等等化学成分在里面。

本发明提供了只有该分子才有的结晶LysB28ProB29-hI的方法，即该条件不使人工胰岛素结晶。该方法可大规模地制备高质量和高收率的锌结晶。该结晶提供一稳定的固体分子形式。结晶状的固体是特别有益的，因为它们与非结晶的固体相比更容易具有特性，更纯，并且药学上更精致。因此，本发明方法适用于大批生产应用。

权利要求1用氯化钴溶液制备结晶氯化钴过程中蒸汽利用的工艺方法，其特征是首先将氯化钴溶液从蒸发前液储罐泵入到蒸发前液高位槽，用第一换热器内的蒸汽对蒸发前液高位槽内的氯化钴溶液进行预热至50—70℃，然后将预热后的氯化钴溶液放入蒸发釜内，通入蒸汽对蒸发釜内的氯化钴溶液加温，蒸发釜真空度为-0.06—0mpa，温度为80—90℃，蒸发结束后将余下的氯化钴溶液放入至结晶釜内进行结晶流程。如图1所示，本发明的用氯化钴溶液制备结晶氯化钴过程中蒸汽利用的工艺方法，首先 将氯化钴溶液从蒸发前液储罐泵入到蒸发前液高位槽，用第一换热器内的蒸汽对蒸发前液高 位槽内的氯化钴溶液进行预热至6(tc，然后将预热后的氯化钴溶液放入蒸发釜内，通入蒸汽 对蒸发釜内的氯化钴溶液加温，蒸发釜真空度为-o. 07mpa，温度为85'c，蒸发结束后将余下 的氯化钴溶液放入至结晶釜内进行结晶流程。用氯化钴溶液制备结晶氯化钴过程中蒸汽利用的工艺方法，其特征是首先将氯化钴溶液 从蒸发前液储罐泵入到蒸发前液高位槽，用第一换热器内的蒸汽对蒸发前液高位槽内的氯化 钴溶液进行预热至50 — 7(tc，然后将预热后的氯化钴溶液放入蒸发釜内，通入蒸汽对蒸发釜 内的氯化钴溶液加温，蒸发釜真空度为-0.06 — 0mpa，温度为80 — 9(tc，蒸发结束后将余下 的氯化钴溶液放入至结晶釜内进行结晶流程。

如以上所述，本发明提供了制备结晶状LysB28ProB29-人工胰岛素的方法。术语“LysB28ProB29-人工胰岛素”或“LysB28ProB29-hI”是较少有二聚作用或自联作用倾向的快速作用的胰岛素类似物。如欧洲专利公布号383,472所述，LysB28ProB29-hI是人工胰岛素，其中在B-链的B28位置上的脯氨酸由赖氨酸取代；在B-链的B29位置上的赖氨酸由脯氨酸取代，将该文献收编在本申请中作为参考。

应用在本申请中所有的氨基酸缩写均符合United States Patent&Trademark Office(美国专利和商标局)37C.F.R.§1.822(b)(2)所规定。

本申请中应用的术语“酚的”或“酚的衍生物”总起来说是指苯酚、间苯二酚、间甲苯酚或对羟基苯甲酸甲酯或它们的混合物。

本申请中应用的术语“结晶”是指生成LysB28ProB29-人工胰岛素结晶。

术语“生理上可耐受的碱”是本技术领域专业人员熟知的。生理上可耐受的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铵。优选的碱是氢氧化铵。

对结晶状胰岛素的生成进行了广泛的研究。人工胰岛素在工业上于0.25N乙酸、1.6～2.1g/l胰岛素和2％锌存在下，在pH5.95～6.05进行结晶。加入碱，通常用氢氧化钠从酸性侧链进行结晶。最令人预料之外的是，在已知的制备胰岛素结晶条件下可溶的LysB28ProB29-hI不出现结晶。目的是使LysB28ProB29-hI有最小的自联和聚集作用。Brems等最早进行了LysB28ProB29-hI不聚集的研究(ProteinEngineering，56，527-533(1992))。最小的自联和聚集作用使该类似物成为单体，据信这是在胰岛素的研究条件下LysB28ProB29-hI未能结晶的主要原因。

本发明叙述了LysB28ProB29-hI与锌和酚的化合物一起形成稳定的结晶状固体的条件。优选的酚衍生物系选自苯酚、间苯二酚或它们的混合物。为了完成结晶过程，锌和酚衍生物是关键性的。

将所述胰岛素类似物溶于水稀释液中制得LysB28ProB29-hI溶液。该LysB28ProB29-hI溶液的浓度为约1.8g/l～2.5g/l。最好该类似物浓度为约2g/l。溶解可以借助于通常称作为酸溶解的方法，即用生理上可耐受的酸(最好是盐酸)使pH降至3.0～3.5。其他生理上可耐受的酸包括乙酸、柠檬酸和磷酸。

选自于乙酸、柠檬酸或甘氨酸的有机酸的浓度至少为0.3N，低于0.3N会产生大量的非晶体产物。将LysB28ProB29-hI溶于约0.8～1.2N乙酸中较好，最好溶于1N乙酸中。

加入的锌浓度是这样的，以致于最终的浓度为每克类似物用约40～400mg。锌最好以盐的形式加入。具有代表性的锌盐的实例有乙酸锌、溴化锌、氯化锌、氟化锌、碘化锌和硫酸锌。熟悉本技术领域的专业人员认识到，还有许多其他的锌盐也可以用于本发明的方法。应用乙酸锌或氯化锌是较好的，因为这些锌盐对于大规模的可以接受的方法不增加新的化学离子。在结晶中锌的适宜浓度为每克LysB28ProB29-hI约100～300mg。

该结晶条件对酚衍生物、碱和锌的浓度是敏感的，即为了获得好的所规定的结晶，实施该方法的熟悉本技术领域的专业人员应该调整这里所规定的参量。并用各个酚衍生物-碱的适宜的条件可在本发明公开的范围内进行改变。酚衍生物为苯酚，其浓度为约0.15～0.25％(V/V，最终浓度)是较好的。苯酚的浓度为0.2％更好。

LysB28ProB29-hI溶于溶液中的方式，或酚衍生物、锌和LysB28ProB29-hI加入到溶液中的顺序对本发明方法来说不是关键性的。但是，在低于LysB28ProB29-hI等电点下使酚衍生物与LysB28ProB29-hI相互反应是重要的。因此，通过加入锌，或者通过加入生理上可耐受的碱使所述溶液从酸性pH调节到约5.5～6.5从而可使结晶过程开始。生理上可耐受的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铵。较好的碱是氢氧化铵。

⑵ pka ： b ＞ a 3．某植物药中含有下列 a、b、c 三种生物碱及水溶性、脂溶性杂质， 酸水（2%h 2 so 4 、2%酒石酸等） 溶解、滤过 氨水调 ph9～10 有机溶剂萃取 总生物碱 酸水滤液 有机溶剂萃取（chcl 3 、苯等） 有机溶剂层 （脂溶性杂质） 酸水层 有机溶剂层 碱水层 1%～2%naoh 萃取碱水层 有机溶剂层 （叔胺碱） nh 4 cl/chcl 3正丁醇层 （季铵碱） chcl 3 层 （酚性叔胺碱） ph＞12 正丁醇萃取 或雷氏铵盐沉淀 水层 （水溶性杂） 原点 前沿（1）写出检识生物碱的试剂组成、现象及注意事项。例如，在一定量的待测酸(或碱)溶液中逐滴滴入已知质量分数的碱(或酸)溶液(这种溶液被称为标准溶液)，直到酸、碱恰好完全反应，根据消耗标准碱(或酸)溶液的多少即可求算出待测酸(或碱)溶液的溶质质量分数。对于发色团上存在酸性或碱性基团的兽药，通过在酸或碱溶液中（常用0.1mol/l hcl溶液或0.1mol/l naoh溶液）最大吸收波长的测试，观察其紫移或红移现象，可为上述酸性或碱性基团的存在提供进一步的支持。

更好的是将LysB28ProB29-hI溶于约1N乙酸中(在溶解中如果需要，该pH可调节至3.0～3.5)。然后将酚衍生物加到上述溶液中并使其平衡。用生理上可耐受的碱使溶液的pH调至约5.5～6.5。人工合成结晶牛胰岛素化学式优选的碱为氢氧化铵，并将pH调节至约5.9～6.2。然后通过加入锌使结晶过程开始。

结晶过程中应用的方式是进行搅动使结晶生成，或者不进行搅动使结晶生成，然后收集结晶并进行洗涤。结晶过程应用搅动是较好的。如果需要，可以将LysB28ProB29-hI进行重结晶，以便容易过滤。可以接通常的方法将该结晶收集、干燥。如果通过过滤收集结晶，那么可以将另外的锌加到滤液中或母液中，以便进一步得到LysB28ProB29-hI。按照本发明以工业规模制得的结晶是高质量和高收率的。上述结晶提供了满足/完成生产的适用于保存和配制的稳定固体形式的大批量药物。该结晶过程不改变药物的纯度或聚集作用动力学。

结晶的温度不是关键性的。可以接受的温度范围为约4～26℃。优选的温度是约22～24℃。

LysB28ProB29-hI可以用各种认可的肽合成技术中的任一方法进行制备，包括经典方法(溶液法)、固相方法、半合成方法以及较近代的DNA体外重组方法。例如，Chance等，欧洲专利公布号383,472公开的制备LysB28ProB29-人工胰岛素方法。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，下述说明仅是示例性的，不限定本发明的保护范围。具体实施例方式下面结合实施例，对本发明做进一步说明:实施例1:一种铝合金缓蚀剂，由下述原料按重量份数比制备而成:亚硝酸钾i份、60份葡萄糖酸钙、5份琉基苯并噻唑、2份硼酸盐以及4份十六烷胺。接下来，通过实施例、比较例、处方例对本发明进行具体说明，但是本发明不仅仅限于下述实施例。