激光共聚焦内镜_近场光学显微镜原理_共聚焦显微镜原理(3)

8．细胞亚微结构(细胞器探针)：共聚焦激光扫描显微镜可获得较分辨率高的细胞内线粒体、高尔基复合体、内质网、溶酶体等细胞器图像，同时还可动态观察活细胞状态下细胞器的形态学变化情况，此外还可通过光学切片即断层扫描技术进行三维重建，显示细胞器的空间关系及其变化。适用于线粒体的荧光探针较多，如Mitotracker、DA SPMI、DA SPEI、JC-1、罗丹明 123等。高尔基复合体常用的荧光探针有NBD 酰基鞘氨醇（ceramide）、BODIPY 酰基鞘氨醇。内质网主要用Dil、DiOC6(3)。溶酶体的荧光探针有DAMP、neutral red。

9．标记抗体、配体等常用的荧光探针：共聚焦激光扫描显微镜不仅可用免疫荧光分析固定的细胞或组织切片，还可用于分析活细胞，得到特异性抗体或其他荧光免疫探针识别靶分子的表达、定位、分布变化等信息。标记抗体、配体或蛋白质等较通用的有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)，在碱性条件下FITC的异硫氰酸基与免疫球蛋白的自由基经碳酰胺化而形成硫碳胺基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子上最多能标记15～20个FITC分子。但FITC易产生光漂白现象，发射带较宽，故在用于双标记时会和其他染料的发射带重叠，且带负电荷，对pH值的变化较敏感，因而限制了其在活细胞检测中的应用。

10．检测酶活性的荧光探针：共聚焦激光扫描显微镜除了具备荧光显微镜检测荧光酶细胞化学的作用以外，在检测活细胞酶活性动态变化方面有着无可比拟的优势。通过对细胞施予不同的处理因素可检测细胞内相应的酶被激活或灭活的动态变化过程。有的酶荧光探针是自身就可发出荧光、有的是与酶结合后发出荧光、有的则是被酶分解后发出荧光。

（三）共聚焦激光显微镜具体操作过程

1.开机步骤：(1)依次稳压电源、显微镜电脑、扫描器、激光电源开关以及相应的冷却系统等、显微镜电源及荧光电源(各按钮间隔时间15s以上)，运行大约15分钟后开启软件。(2)选择合适的物镜、视野，通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块，“TL/IL”功能键在明视场和荧光之间切换，进行样品的荧光观察。

2.关机步骤：(1)将激光输出功率调到最小，关闭激光器电源，保持冷却系统继续工作10分钟以上再关闭开关。（2）推出计算机系统，关闭计算机。（3）关闭系统总开关。（4）清理镜头，若使用过油镜，需用清洁液或无水乙醇清洁镜头。（5）显微镜光学系统冷却后，盖好仪器防尘罩。

（四）细胞准备与制片

1.成纤维细胞传代培养，至细胞对数生长期，将细胞用胰蛋白酶消化后，接种细胞（5×105）到放置有处理过的盖玻片的培养皿中，37℃二氧化碳培养箱中孵育2天。

2.取出盖玻片，用PBS或Hank’s液洗涤细胞2次。

3.滴加20µ M Rhodamine 123 缓冲液（或用其他荧光染料，如DAPI，）或相应的荧光抗体，如抗β-Actin荧光抗体示细胞骨架微丝）3-5滴于盖玻片上，放置湿盒内，在37℃下孵育30min。

4.去除Rh123缓冲液，并用培养基洗涤细胞2-3次。

5.于10%福尔马林缓冲液并孵育15～20min，用PBS洗涤3次。

6. 用带有荧光素滤光片的共聚焦显微镜观察细胞。

五.实验结果记录

图3-2为细胞自噬的共聚焦显微镜观察结果。细胞通过抗LC3、抗β-Actin的荧光抗体和DAPI （2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidinedihydrochloride）染色处理，然后在共聚焦显微镜下观察。

A B

图3-2 细胞自噬的共聚焦显微镜观察结果图

共聚焦显微镜观察黑色素瘤细胞自噬相关蛋白LC3的表达。A 对照，BLC3表达情况。红色为抗LC3抗体染色，示细胞自噬情况，蓝色为DAPI染色，示细胞核，绿色为抗β-Actin（细胞骨架微丝主要成分）荧光抗体染色，示细胞质。

六.注意事项

1.关机时一定等激光冷却后再按下开关（Remote Switch）关机。

2.汞灯电源关断后，再开启汞灯要等30min以上。

3.使用中不得随意关断显微镜、控制箱等的电源。

4.主机电脑中不得再安装其他硬件、软件（严防电脑病毒），不得删除主机电脑中的程序。

5.装卸物镜、DIC片要轻拿轻放，勿震动。

6.油镜用后一定清洁，不得使用二甲苯。

7.平时注意整机防尘。

8.荧光标记样品要尽快上机采集图像，防治应该淬灭及细胞干燥等导致荧光变化。