激光共聚焦内镜_近场光学显微镜原理_共聚焦显微镜原理(2)

（二）共聚焦激光扫描显微镜的应用

LSCM检测内容和应用范围非常广泛，以下仅简单介绍LSCM常用的检测内容及其荧光探针。共聚焦显微镜原理

1．细胞内游离钙：共聚焦激光扫描显微镜常用的有Fluo-3、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，前两者为单波长激光探针，利用其单波长激发特点可直接测量细胞内Ca2+动态变化，为钙定性探针；后两者为双波长激发探针，利用其双波长激发特点和比率技术，能定量细胞内[Ca2+]，为钙定量探针。

2．DNA和RNA核酸的荧光探针：用于共聚焦激光扫描显微镜的主要有吖啶橙(Acridine Orange，AO)、碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)。两种染料既可标记DNA又可标记RNA，如为获得单独的DNA或RNA分布，染色前可用RNA酶或DNA酶处理细胞。PI不能进入完整的细胞膜，故不能标记活细胞内的DNA和RNA。

3．膜电位：共聚焦激光扫描显微镜可利用荧光探针在细胞膜内外分布的差异测出膜电位，可以观察细胞膜电位的变化结果，还可以用于连续监测膜电位的迅速变化。膜电位荧光探针根据其对膜电位变化反应速度的快慢分为快、慢两类探针。DiBAC4(3)为最常用的膜电位荧光探针，为带负电荷的阴离子慢反应染料。该探针本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，测量时要求细胞浸在荧光染料中。当细胞内荧光强度增加即膜电位增加示细胞去极化；反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低示细胞超极化。共聚焦显微镜原理Rhodamine 123主要用于线粒体膜电位测量，是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线粒体膜内侧负电荷增多时，荧光强度增加。

4．pH值：正常细胞胞浆内的pH一般在6.8～7.4的范围，而某些细胞器如溶酶体的pH则在4.5～6.0之间。根据检测对象pH的不同将荧光探针分为用于偏中性和酸性两类。常用于偏中性pH即细胞胞浆pH检测的荧光探针有SNARF类(SNARF-1、SNARF-calcein)、SNAFL类(SNAFL-1、SNAFL-calcein)、BCECF等。

5．细胞内活性氧基：活性氧(active oxygen species)可影响细胞代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有一定的意义。根据检测活性氧的不同可选择不同的荧光探针。常用荧光探针有Dichlorodihydrofluorescein diacetate（2，7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸、H2DCFDA)，其原理是不发荧光的H2DCFDA进入细胞后能被存在的过氧化物、过氧化氢等氧化分解为二氯荧光黄（dichlorofluorescein，DCF)而产生荧光，其反应灵敏到10～12 mole水平，荧光强度与活性氧的浓度呈线性关系。

6．细胞间通讯：共聚焦激光扫描显微镜可采用荧光光漂白恢复(fluorescence recovery after photobleading，FRAP)技术检测细胞缝隙连接通讯，该方法的原理是一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去发光能力。而临近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到已被漂白的细胞中，荧光可以逐渐恢复。由于光漂白过程是不可逆的，因此可通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来判断细胞缝隙连接的通讯功能。采用FRAP技术检测细胞间通讯常用荧光探针是6-carboxyfluorescein diacetate(6-羧基荧光黄乙酰乙酸盐、CFDA)，需用其酯化形式CFDA-AM。

7．细胞膜流动性：采用荧光光漂白恢复(FRAP)技术还可对细胞膜流动性进行研究。利用NBD-C6-HPC荧光探针标记细胞膜磷脂，然后用度的激光束照射活细胞膜表面的某一区域(1～2μm)，使该区域的荧光淬灭或漂白，再用较弱的激光束照射该区域。可检测到细胞膜上其他地方未被漂白的荧光探针流动到漂白区域时的荧光重新分布情况。荧光恢复的速率和程度可提供有关的信息。