藏獒分子标记的特异性引物及检测方法与流程

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及家犬品种藏獒单核苷酸变异及微卫星标记的特异性引物及检测方法技术领域。

背景技术：

赤古是近年青海玉树藏獒的典范，现在，每当谈起牧区谈藏獒，就不得不提到赤古，它优秀的头版，纯正的铁锈红，极强的遗传，红透半边天的后代，极高的空怀率，以它今日的声望，看看它主人的大金链子，再看看它的狗窝，这些，都是浓浓的藏区味道...。就像藏獒的个体差异也很大，也有人说藏獒遗传不稳定，可是当你看到一只藏獒时你一样的能够很轻易的分辨出是一只藏獒，说明其共性是大于个体差异的，中华田园犬也是如此。把比赛成绩好的赛犬当作顶级种犬，一只遗传极差，并且生育能力都成问题的顶级赛犬关八州被国人像神一样追捧，这不能不说是中国秋田繁殖的悲哀。

技术实现要素：

本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种藏獒分子标记用的特异性引物并交代了详细的检测方法，对藏獒犬的遗传特征、谱系地理格局、群体结构的分析，以及种质资源的科学保护与利用均具有重要的应用价值。

本发明采用如下技术方案实现。

一种SNP分子标记引物，本发明该分子标记引物择一包含以下引物对；

TM-P1：F:TGCAAGGAGGAGGAAGAAGG，

R:CTCCCAGTCTCTTGCCTCTG；

TM-P2：F:TGCAAGGAGGAGGAAGAAGG，

R:CTCCCAGTCTCTTGCCTCTG；

TM-E：F:CATTCAGTCAGCATTTCTGC

R:GGGCTGCAGGTTGCGAGGGT；

TM-M：F:TTCTTACATGGCAGCTGGTG，

R:CTTTTCCCTGTGAGCTCTGG；

TM-M1：F:GCTGCAATCCACAATGAAGA，

R:ATGCAGTCAGAACCCCAAGT；

TM-H1：F:GAGGCTTCAAATGCCTTGAG，

R:CATGCCTTAGGGGCAGTAAA；

TM-H2：F:GAGGCTTCAAATGCCTTGAG，

R:CATGCCTTAGGGGCAGTAAA；

TM-C：F:AGTCCCCAGAAGGTTCCATG，

R:GCAACCGGTGGAAAGTTTCT；

TM-S：F:GGCCTCCATGCTTAGCTCTA，

R:AGCACCTTACAGACTCCACC；其中F为上游引物，R为下游引物。

一种SNP分子标记引物组，本发明该引物组包含以下任意两组引物对及其以上的组合；TM-P1、TM-P2、TM-E、TM-M、TM-M1、TM-H1、TM-H2、TM-C、TM-S；具体序列如上述记载。

一种SSR分子标记引物，本发明该分子标记引物择一包含以下引物对；

TM-CAS5：F:TCCCTCCTCAGCAGAGAGTC，

R:AACCTCAGGGCTATTCATTTCA；

TM-CAS6：F:TCCCTCTCCCTGTGTCTCTG，

R:CAATCCTTGAGCATGAAACG；

TM-CAS7：F:ACTGTCCTGGTGCCACCTAC，

R:CAACATCCTCTCCCCTGAAA；

TM-CAS8：F:CCACAAAAGACCCACCCATA，

R:CTTCATGGAGCCTGCTTTTC；

TM-CAS9：F:GCTTTTGCTGTGTCCCAAAG，

R:AACTGTGGCCATCATTAGCA；

TM-CAS10：F:TGGCAACATGCTGAAAGTGT，

R:AGGTGGGCTCTGTGACCATA；

TM-CAS11：F:CTCCCTCTGCCTGTCTTCTG，

R:CTTGGGTGCAGAGCTAGTCC；

TM-CAS12：F:TACATCAGCCCCTGCTTTCT，

R:TTGGCTTTAGTTCAGATGGAAG；其中F为上游引物，R为下游引物。

一种SSR分子标记引物组，本发明该引物组包含以下任意两组引物对及其以上的组合；TM-CAS5、TM-CAS6、TM-CAS7、TM-CAS8、TM-CAS9、TM-CAS10、TM-CAS11、TM-CAS12；具体序列如上述记载。

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计合成引物,从菊苣叶绿体基因组中扩增包括rps7-rps12-trnv-16s-rdna基因在内的一段序列(genbank登录号为gq199478),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段.以叶绿体基因强启动子prrn驱动选择标记基因aada及报告基因gfp构建多顺反子表达盒prrn-aada-gfp-psba-3′,然后将表达盒克隆进菊苣叶绿体同源片段中,获得菊苣叶绿体定点整合表达载体pjag,酶切分析证明所构建的载体符合预期设计.该载体的构建为建立菊苣的叶绿体转化体系奠定基础,为进一步通过叶绿体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良,或以菊苣叶绿体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台.。红色字体即为ssr位点，在得到这些ssr位点后，就可以直接拿来设计引物，引物设计软件很多，我一般习惯使用ncbi的在线引物设计，因为玉米的基因组序列已存在，当其设计好引物后，会自动在数据库里搜索一翻，如果匹配到其他位点上，给出的引物报告单会自动注明，可以选择是否用该标记。tail-pcr的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（special primer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp），用它们分别和1个具有低tm值的短的随机简并引物（arbitrary degenerate prime，ad，约14bp）相组合，以基因组rma为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。

使用上述引物或引物组的用途，该用途为鉴定或区分藏獒犬和其它家犬。

本发明提供一种藏獒单核苷酸标记的检测方法，包括以下步骤：

(1)、提取藏獒基因组DNA；

答案：a12．下列关于中心法则的叙述中，错误的是()选项 模板 原料 产物 过程 a dna 脱氧核苷酸 dna dna复制 b dna 核糖核苷酸 rna 转录 c rna 核糖核苷酸 rna rna复制 d rna 核糖核苷酸 dna 逆转录 解析：逆转录是以rna为模板、脱氧核苷酸为原料合成dna的过程。首先，用电转到已经转化了pkd46的car015感受态细胞中，用glpr-catsacb基因片段替换glpr基因，用引物cat-up/glpr-300-o-r来验证成功转化的菌，glpr-catsacb基因片段是以pxz-cz质粒为模板[]，用引物glpr-cat-up/glpr-cat-down () 扩增得到()。建立一种利用荧光定量pcr扩增反应进行单核苷酸多态性(snp)快速测定的方法.以人β肾上腺素受体2基因中的arg16gly为研究对象,利用荧光染料sybrgreenⅠ标记定量pcr产物,通过pcr生长曲线和融解曲线分析结果进行snp分型.为提高snp测定的特异性,分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物3′端倒数第3个碱基位置,引入了一个人为错配碱基,使引物的错误延伸率显著降低,大大提高了snp分析的准确性.通过dna测序验证荧光定量pcr对β肾上腺素受体2基因中arg16gly分型结果的准确率.实验结果表明,所建立的方法操作简便,结果准确,适合进行大规模样品的snp检测工作.。

(3)、利用ABI3730测序仪对PCR扩增产物进行测序；

(4)检测单核苷酸多态位点。

根据测序结果，对重组质粒ppink-lc-hsa进行结构描述如下:在ppink_lc载体的ecori和kpni酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第7-1842位核苷酸所示的双链dna分子。根据测序结果，对重组质粒pgagz a a-hsa进行结构描述如下:在pgagz a a载体的bstbi和kpni酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第10-1842位核苷酸所示的双链dna分子。我们往往通过同功或同类蛋白的氨基酸保守区域得到参考核苷酸序列就是不完全未知的序列，一些碱基位是不确定的，可能出现两种、三种或者四种。

利用本发明中的藏獒单核苷酸标记的特异性引物对100个家犬样品(包含50只藏獒，50只其它犬种)进行了检测，结果表明，9个单核苷酸多态位点能够有效扩增，扩增效率达到100％，利用ABI3730测序仪检测表明，9个单核苷酸多态位点均表现出藏獒特异的变异，说明本发明中的9对单核苷酸标记的特异性引物能够用于藏獒的品种遗传特征鉴定工作。

本发明公开了一组能够高效扩增藏獒群体单核苷酸标记的特异性引物及检测方法，且本发明的单核苷酸多态位点具有藏獒群体特异的变异，因此，本发明提供的藏獒单核苷酸标记的特异性引物及检测方法可应用于在藏獒的品种遗传特征鉴定等领域。

本发明提供一种藏獒微卫星标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、提取藏獒基因组DNA；

(2)、以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用所述的藏獒微卫星标记的特异性引物中的每个微卫星位点的特异性引物分别进行PCR扩增；

(3)、利用ABI3730测序仪对PCR扩增产物进行多态性检测。

本发明通过构建藏獒群体基因组数据库，筛选含有微卫星序列的DNA序列，设计微卫星位点的特异性引物，并对这些微卫星位点进行了多态性检测，开发了8个多态性丰富的藏獒微卫星位点。8个微卫星位点的编号分别为：TM-CAS5，TM-CAS6，TM-CAS7，TM-CAS8，TM-CAS9，TM-CAS10，TM-CAS11，TM-CAS12；其核苷酸序列分别如表2所示。

就像藏獒的个体差异也很大，也有人说藏獒遗传不稳定，可是当你看到一只藏獒时你一样的能够很轻易的分辨出是一只藏獒，说明其共性是大于个体差异的，中华田园犬也是如此。 藏獒无论是力量，敏捷性，相当於普通人家比较能打架的小孩、标准藏獒 成年公獒肩高68—75厘米(母獒65厘米以上),腰背长度75厘米左右(从犬肩胛上量至犬臀的尾根上部),胸围95厘米左右,全身结构符合藏獒各项要求者为巨獒,体重多为50千克左右,其他各项规定达标者为普通型藏獒藏獒毛圣。另外一种方法是，一条犬父母有一方或者两方都未在cku登记，则需要办理cku纯种犬鉴定证书，也即经过cku的专业鉴定之后，为纯种犬则办理纯种犬鉴定证书，这个证书对于家庭饲养者来说毫无疑义，因为鉴定证书体现不出父母犬和祖先犬的任何内容，无法清查血统，实际就像没有血统一样，是无法确定会再该犬身上体现出何种遗传特性的。

葡萄遗传学专家指出：" 新的基因组信息能够用来鉴定遗传标记，帮助人们开发抗病新品种，从而获得高质量、口味好，且环境适应能力更好的酿酒葡萄。 第二类是以聚合酶链式反应 pcr 为核心的dna分子标记,包括随机扩增多态性dna标记 rapd 、简单序列重复标记 ssr 、重复序列之间长度多态性 issr 、扩展片段长度多态性标记 aflp 等 二、分子标记的应用 dna分子标记是继形态标记、细胞学标记、生化标记之后发展起来的一种新的更为理想的遗传标记,它促进了植物遗传育种的研究,在花卉研究中也得到了广泛的应用。 花卉遗传图谱的构建工作已经开展,用239个rapd标记、38个rflp标记、2个ssr标记成功地构建了北美杜鹃的分子遗传图谱。

下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

附图说明

图1a为本发明使用引物对TM-E扩增所得的单核苷酸PCR产物的琼脂糖胶电泳图。

图1b为本发明使用引物对TM-M扩增所得的单核苷酸PCR产物的琼脂糖胶电泳图。

图1c为本发明使用引物对TM-M1扩增所得的单核苷酸PCR产物的琼脂糖胶电泳图。

图2为采用本发明方法分辨藏獒和其它家犬的示意图。

图3为采用本发明方法分辨藏獒亚群体的示意图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例：

一、藏獒基因组DNA的提取

1、试剂配制：

消化缓冲液：称取Tris1.2114g，EDTA37.224g，SDS5g，用灭菌超纯水定容只1000mL(终浓度为Tris10mmol/L，EDTA0.1mol/L，SDS0.5％)，调节至pH值至8.0，4度保存备用。