单细胞测序技术揭示基因组异常在常见肿瘤发生与转移中的作用

研究背景和目的恶性肿瘤是世界范围内威胁人类生命健康的重大疾病。肿瘤难以治愈,致死率高,其核心原因就是肿瘤的复发和转移。肿瘤转移是个复杂的、多步骤的过程,肿瘤干细胞、循环肿瘤细胞、微小转移灶都可能在肿瘤转移和复发中起到重要的作用。恶性肿瘤在发生发展过程中都伴随着基因组的改变,因此对肿瘤进行基因水平分析能更进一步了解其分子特征和发生发展的机制。然而这些在肿瘤转移过程中发挥重要作用的肿瘤细胞或者转移灶一般都由微量细胞组成,甚至以单个细胞形式存在,越来越多的研究也证明肿瘤细胞之间存在广泛的异质性,而传统的生物学、医学研究手段往往基于大量细胞进行分析,在研究以上问题时遇到瓶颈,对其基因组特征以及在肿瘤转移复发过程中的分子机制尚不明确。因此从单细胞层面才能更加准确深刻地揭示肿瘤遗传学的本质特征。本课题研究将应用单细胞测序技术,建立常见肿瘤的肿瘤干细胞、微转移、循环肿瘤细胞的分离、单细胞测序及生物信息学分析的方法;实现对肿瘤患者肿瘤干细胞、肿瘤微转移、外周血循环肿瘤细胞的精确识别与分离,并对其基因组进行深入分析,在单细胞水平探寻肿瘤干细胞、微转移和循环肿瘤细胞与肿瘤发生、转移密切相关的关键驱动事件,揭示肿瘤发生、复发、转移及耐药的关键生物学机制,为最终实现肿瘤精准的个体化治疗提供新的依据。

研究方法1)通过荧光流式分选技术富集并分选新鲜肝癌组织肝癌干细胞,显微镜下挑选单个细胞。2)通过Cell Search?系统富集外周血循环肿瘤细胞,荧光显微镜下挑选单个细胞。通过核分离技术分离冰冻原位肿瘤组织细胞核,显微镜下确认荧光和形态,将单个肿瘤细胞核挑出。3)通过多重退火和环化循环扩增技术对单个细胞进行扩增,全基因组文库构建并测序,分析单个细胞中的拷贝数变异。通过外显子测序,分析单核苷酸变异。4)提取癌组织、相应癌旁组织和血液样本DNA,进行外显子测序,分析单核苷酸变异,通过定点PCR扩增与Sanger测序,在单细胞样品中验证突变位点。5)通过显微切割技术精确获取肝细胞肝癌病灶的肿瘤组织,并提取DNA。将不同病灶DNA进行外显子测序和全基因组测序,分析单核苷酸变异和拷贝数变化,Sanger测序验证突变位点。研究结果1)肝癌组织中CD44+CD90+干细胞比例占所有细胞的0.5%,肝癌组织中,CD44+CD90+干细胞以及CD44-CD90-肿瘤细胞大范围拷贝数变化一致,局部区域具有异质性。2)肝癌干细胞的拷贝数变化在进化过程中积累全基因组测序揭示肝癌相关基因突变,根据肝癌干细胞中拷贝数变化模式,可以对肝癌细胞进行分群。

3)肝细胞肝癌单核苷酸变异特征以C:G>A:T为主,同时发现COL14A1、PLCB4、ACY1等新的突变,其在肝细胞肝癌中的作用有待进一步研究。4)10例肝细胞肝癌患者均发生Chr1q拷贝数扩增,Chr4q和16q拷贝数缺失。5)结肠癌组织中原位肿瘤细胞拷贝数变化具有异质性,循环肿瘤细胞拷贝数变化具有高度一致性,转移灶组织拷贝数变化与循环肿瘤细胞相似。6)乳腺癌与胃癌中,来自同一病人的循环肿瘤细胞拷贝数变化具有高度一致性,前列腺癌中同一病人的循环肿瘤细胞拷贝数变化根据局部区域扩增或者缺失可分为两个不同亚群。7)不同癌种循环肿瘤细胞单核苷酸变异分析发现ECM相关基因突变富集。结论1)肝癌干细胞和肝癌细胞中拷贝数变化都存在异质性;肝癌干细胞的进化遵循渐进模式,肝癌细胞是由不同进化阶段的肝癌干细胞分化而来;肝癌中存在正常干细胞;目前根据细胞表面标志物CD44和CD90分选肝癌干细胞并不具有特异性。2)肝细胞肝癌患者基因组变化具有复杂性,需要综合考虑病人之间的异质性,针对性地实施个体化治疗。3)结肠癌原位肿瘤细胞拷贝数变化遵循渐进进化模式全基因组测序揭示肝癌相关基因突变,而单核苷酸变异则是不规律的分散进化,循环肿瘤细胞可能来源于一群高度进化的原位肿瘤细胞。大多数病人循环肿瘤细胞拷贝数变化具有高度一致性,病人间的循环肿瘤细胞拷贝数变化具有癌种差异性;循环肿瘤细胞中富集ECM相关基因的突变,推测其在肿瘤转移中发挥重要作用。