兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特性【精品论文】

兔 VX2 肿瘤的离体培养及有关生物学特性 ——作者： 小小小作者： 苏畅， 张惠中， 李文海， 林芳， 梁晓华， 江吕泉， 程庆书 【关键词】 肿瘤细胞Culture in vitro and related biological characteristics of rabbit VX2 carcinoma cells 【Abstract】 AIM: To separate and purify the rabbit VX2 carcinoma cell line in vitro and to characterize its biological features。 METHODS: VX2 tumor fragments were isolated and cultured with explant culture techniques and enzymatic digestion in vitro。 After 40 passages, the cell morphology, cell cycle, karyotype and tumorigenecity in rabbits and nude mice were investigated。

RESULTS: The newly established cell line VX2 was maintained in continuous culture over 50 passages for 8 months。 Morphologically, VX2 cells were uniform, round and polygonal epithelial cells。 The cells were small but had a high nucleocytoplasmic ratio。 The cell cycle analysis showed 74。 61% in G1 phase, 7。 78% in G2 phase and 17。 6% in S phase。 The population doubling time was 26。 4 h。 The chromosomal analysis showed a hypotriploid with a median chromosome number of 60。 The tumorigenecity in rabbits and nude mice will be ensured under a high VX2 cell inoculating concentration。

CONCLUSION: The VX2 is a squamouscell carcinoma resulting from malignant change in a papilloma induced with the Shope virus in rabbits。 It has already been purified in vitro, and can be applied to further researches。 【Keywords】 rabbits; tumor cells, cultured; tumor markers, biology 【摘要】 目的： 在体外分离纯化 VX2 肿瘤细胞， 观察其生物学特性。 方法： 采用组织块法和消化法结合对兔 VX2 肿瘤进行原代培养, 体外传代观察, 传代 40 次并对培养细胞进行形态 学观察、 细胞周期检查、 核型分析、 兔及裸鼠移植。 结果： 纯化的兔 VX2 肿瘤细胞形态一致， 呈圆形、 多角形的上皮细胞, 体积小, 核浆比倒置, 体外连续培养 8 mo, 传代 50 次以上, 细胞倍增时间为 26。

4 h,细胞周期测定 G1 期为 74。 61%, G2 期为 7。 78%, S 期为 17。 6%。 染色体为亚三倍体核型, 众数为 60 条。 高细胞浓度可保证同种移植成瘤率, 裸鼠移植可成瘤, 无支原体污染。 结论： 兔 VX2 肿瘤细胞系来源于 Shope 病毒致乳头瘤恶变形成的鳞状上皮细胞恶性肿瘤, 目前已经纯化， 可应用于进一步肿瘤实验研究。 【关键词】 兔; 肿瘤细胞, 培养的; 肿瘤标记, 生物学0 引言 兔 VX2 肿瘤是来源于 Shope 病毒致乳头瘤恶变形成的上皮细胞恶性肿瘤，属于鳞状细胞癌， 1940 年建株［1］ ， 国内文献对其来源描述不统一。 其特点可接种在兔体内， 具有较高的肺、 肝转移特性， 在大型动物模型的研究上具有很高的应用价值。 国际上一直没有建成受到公认并广泛使用的 VX2 细胞系， 多数仍以组织块方法保存。 为进一步进行离体研究， 我们分离并纯化了 VX2 瘤株， 并进行了生物学特性观察。 1 材料和方法 1。 1 材料新西兰大白兔 9 只和 BALB/c 裸鼠均购自第四军医大学实验动物中心； 原代培养所用肿瘤组织来源于本院液氮保存冰冻组织块， 于新西兰大白兔腿部肌肉内接种并增殖。

如小鼠nih3t3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的dmem液，37℃、5%co2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。近年来又发现松茸含有具备抗瘤活性的“松茸多糖”，这是其他植物都没有的特殊双链生物活性物质，它具有超强抗基因突变能力和强抗癌作用，它能自动识别肿瘤细胞所分泌的毒素，靶向性地与肿瘤细胞靠近、结合，通过溶解肿瘤细胞膜和破坏脂质双层进入细胞内，封闭肿瘤细胞的转体蛋白受体，阻断肿瘤细胞的蛋白质合成，使肿瘤细胞不能分裂繁殖以至死亡，破坏肿瘤细胞遗传复制的dna基因，从而达到抗基因突变，抑制肿瘤和控制肿瘤复发、转移的目的。1. 细胞计数、稀释细胞悬液，接种96孔细胞培养板，培养。

消化法第 2 日即见细胞生长。 组织块法于第 3 日组织块均浮起， 可见细胞生长。 于岛状生长的细胞处在倒置显微镜下无菌刮取， 培养， 取得多瓶纯化细胞， 其形态、 生长速度基本一致。 待细胞成片生长、 占据大部分瓶底时即用 2。 5 g/L 胰蛋白酶于 37℃下消化传代。 1。 2。 2 形态学观察分别取纯化后第 10 代和 50 代的细胞进行细胞爬片、 HE染色、 倒置显微镜镜下观察。 将 VX2 瘤接种于兔腿部肌肉， 待成瘤后切片光镜下观察。 1。 2。 3 生长特性测定将第 50 代细胞以 1×107/L 的密度接种于 24 孔板， 每孔加入含 100 mL/L FBS 的 1640 培养基 0。 5 mL， 置细胞培养箱中培养。 每日同一时间用胰蛋白酶消化 3 孔细胞， 血球计数板进行计数， 连续进行 4 d， 绘制细胞生长曲线。 利用 SPSS 软件指数函数拟合模型(Exponential) 辅助计算细胞群体倍增时间［2］ 。 制作细胞爬片， 分别于贴壁后 24， 48， 72 h 计算分裂指数。1。 2。 4 琼脂集落形成率测定收集第 52 代细胞和相应的对照细胞， 制备含细胞的 3。

2．3．2接种前细胞的准备 a375细胞传代至对数生长期后收集所需细胞数瓶，pbs液清洗2次，经胰酶消化至细胞大部分变圆，倒掉消化液，加入高糖dmem培养液，1000转离心5rain，加入4mlpbs液重悬浮细胞后如上条件再离心一次。目的:在神经元的发育过程中,骨形态发生蛋白具有多向诱导功能,实验观察不同浓度骨形态发生蛋白4对端脑胆碱能前体细胞发生和分化的影响,探寻其诱导条件及作用规律.方法:实验于2004-11/2005-03在吉林大学白求恩医学院组织胚胎学教研室细胞培养室和免疫组化实验室完成.采用无血清原代培养e16大鼠端脑细胞,分别在实验组培养液中加入终浓度为10,20和40 μg/l骨形态发生蛋白4,细胞培养4 d时,实施乙酰胆碱转移酶免疫细胞化学染色,同时计算乙酰胆碱转移酶免疫反应阳性细胞的百分率.结果:乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应细胞分布于对照组和实验组细胞团的边缘和细胞团之间.20 μg/l骨形态发生蛋白4组细胞团之间分散的细胞多伸出突起为乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应,可见少量具有典型放射状胶质细胞形态的细胞也呈乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应.10 μg/l骨形态发生蛋白4组与对照组相比乙酰胆碱转移酶免疫反应阳性细胞数量差异无显著性(p＞0.05),20 μg/l骨形态发生蛋白4组乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应细胞数量明显多于对照组(p＜0.05),40 μg/l骨形态发生蛋白4组乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应细胞数量明显少于对照组(p＜0.05).结论:低浓度(20 μg/l)骨形态发生蛋白4可诱导端脑胆碱能前体细胞发生和分化。5）将培养液转移至50ml离心管或广口瓶中（若细胞漂浮严重，离心培养基，1000g*5分钟，将离心后的培养基转移至另一个大离心管中vx2肿瘤是什么肿瘤，留一点吹打细胞沉淀成悬液，回收细胞至原培养瓶），若漂浮不严重，亦离心一下。

之后加入新鲜固定液 8 mL， 轻轻吹打均匀， 离心 10 min； 本步骤再重复 2 遍。 末次离心后， 小心吸除大部分上清液， 余下 0。 5～1。 0 mL 固定液， 轻轻吹打调匀。 吸少量细胞悬液， 滴落在-20℃预冷过的洁净载玻片上, 迅速在酒精灯火焰上烤干。 制备好的玻片立即用 Giemsa 染色。 显微镜下观察染色后的标本， 统计其染色体数目。 1。 2。 7 细胞周期测定用 2。 5 g/L 胰蛋白酶加 0。 25 g/L EDTA 消化培养细胞， 确保细胞尽可能打散， PRM 1640 重悬后移至 1。 5 mL 离心管中， PBS 离心清洗 3 遍后， 加入 DPBS（Dulbeccos phosphate buffered saline） 配制的 750 mL/L 冰乙醇， 4℃固定 2 h 或过夜， PBS 再离心清洗 1 遍后用 1 g/L RNase 37℃消化 20～30 min， DPBS 离心清洗 2 遍， 300 目尼龙网过滤， 0。 2～0。 3 mL DPBS 重悬， PI 染色 5 min 后流式细胞仪测定细胞周期。 1。

2。 8 同种异体移植取第 60～70 代的对数生长期细胞， 将新西兰兔分为 3组， 每组 3 只， 分别以 1×109， 1×1010， 1×1011 个/L 的细胞悬液 4 mL 接种于兔腿部肌肉， 观察肿瘤在肌肉内的生长情况。 1。 2。 9 裸鼠移植取第 60～70 代对数生长期细胞 2×1011 个/L, 接种于 3 只BALB/c 裸鼠腋窝皮下, 每只 1 mL， 观察肿瘤在肌肉内的生长情况。 1。 2。 10 支原体及致高钙血症能力检测采用地依红染色及肉汤培养法检测培养液及细胞内支原体。 对成功接种 VX2 瘤的兔子进行耳缘静脉采血， 检测血清钙离子浓度［3-4］ 。 1。 2。 11 细胞系的维持、 冻存与复苏取对数生长期细胞， 用 DHanks 液漂洗 3遍， 2。 5 g/L 胰蛋白酶加 0。 2 g/L EDTA 消化细胞 5 min， 收集细胞， 800 r/min 离心 5 min， 用 1640 培养液重悬细胞， 每瓶细胞分种 3～5 瓶， 同时冻存适量细胞， 冻存液为培养液中加入 100 mL/L 血清及 80 g/L 二甲基亚砜， 放入液氮罐中保存。

将盛有 VX2 细胞的冷冻管（已冷冻保存 1 mo） 从液氮中取出，37℃水浴， 使细胞迅速融化， 将细胞悬液移入预温至 37℃、 含有 100 mL/L 血清的 1640 培养液中， 置于 37℃， 50 mL/L CO2 及饱和湿度的培养箱中培养， 细胞的成活率大于 80%。 2 结果 2。 1 细胞形态最初纯化的细胞部分在相差显微镜下可见扇形细胞质（fanlike membranes） （图 1） , 经过一段时间传代， 细胞呈上皮样细胞排列, 单层贴壁生长, 有铺路石征， 生长成团后即出现重叠生长现象， 细胞以多边形为主（图 2） 。 HE 染色见细胞轻度嗜碱, 核大, 核质比例异常, 细胞呈异型性明显， 可见较多核分裂象(图 3) 。 2。 2 生长特性细胞生长于第 3 日达到高峰。 细胞倍增时间为 26。 4 h。 第 55代细胞的生长曲线见图 4， 细胞分裂指数分别为： 24 h， 1。 9%； 48 h， 7。 0%；72 h， 9。 3%。 双层琼脂形成率为 22。 1%。 图 1 倒置显微镜下兔 VX2 肿瘤细胞呈扇形细胞质×400（略） 图 2 传代后倒置显微镜下兔 VX2 肿瘤细胞呈多边形为主×100（略） 图 3 兔 VX2 肿瘤细胞形态 ×100（略） 2。