酚-氯仿-异丙醇抽提DNA

用酚抽提细胞DNA时dna抽提 饱和酚，有什么作用？

使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。

前者是指在生物环境下，材料通过细胞活性，能部分或全部被溶解或吸收，并与骨置换而形成牢固结合的生物材料。野菊花水提物及水蒸气蒸馏法提取的蓝绿色挥发油对多种致病菌、病毒有杀灭或抑制活性，水提取物对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠埃希菌、伤寒杆菌等的抑制活性强于挥发油。 真核细胞rna的分离纯化—rna制备的条件与环境 措施： 1）尽早、尽快地抑制内源性rnase的活性，rnase抑制剂有： 一般蛋白变性剂 蛋白酶k、sds、酚/氯仿等 rnase的特异抑制剂 异硫氰酸胍、 rnasin、 焦磷酸二乙酯depc、氧钒核糖核苷复合物。

氯仿的作用？

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）

用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？

偶氮类引发剂是指分子中含有偶氮基的一类化合物,有偶氮二异丁睛引发剂和偶氮二异庚睛引发剂.偶氮二异丁睛是常用的引发剂,一般在45 9c-- 65℃使用,热分解只产生一种自由基,该引发剂分解为一级反应,比较稳定.一般在低于80℃条件下使用较好,因为超过80℃就会激烈分解. 偶氮类化合物作引发剂与过氧化物相比有很多优点,它氧化能力小,在50℃一80℃能以适宜的速度分解,其分解速度受溶剂影响较小,无诱导分解,碰撞时也不会爆炸,产品易提纯,价格便宜.。全色谱层析技术保证了产品的高纯度、蛋白完整性、无辛酸残留及提取过程无热或溶剂引起的变性效应。本工艺的特征在于采取两种变性溶解剂体系,进行两次变性溶解、纯化,及先复性后纯化的程序,因而本发明比已有技术可使重组蛋白的溶解度增加500—600倍,变性剂的用量减少100倍左右,工作效率相应提高上百倍,重组蛋白纯度提高30%左右,而产品总收率增加24%以上,因此本发明是工艺简单、产品纯度及收率均明显提高、成本则显著降低、经济效益甚高的提取纯化新工艺。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

在溶液ph等于它们的等电点时，分子呈现电中性，净电荷为零。 2．尖端放电 由于导体尖端的_________很大，其附近电场_____，使周围中性空气分子电离，变成带电离子，这些带电粒子在强电场加速下，会使更多的空气分子电离，产生大量的__________，与导体尖端的电荷符号相反的粒子被____到尖端，跟尖端上的电荷_____，这相当于尖端_____电荷，这个现象叫尖端放电。tpe(tetraphenylene) 是一种经典的aie（aggregation induced emission 聚集诱导发光）分子，即在溶液中没有荧光，但是固体却存在较强的荧光，与传统聚集淬灭分子刚好相反，因此在有机光电材料等领域具有重要的应用，也越来越多的引起人们的关注。

原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。

将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。

溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60 ℃水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟；

溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min，加125ul 20%sds振荡处理15min，离心，分装ep管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200ul te 溶解。加入等体积的氯仿混合,5 000 r·min - 1离心20 min ,取上清。红细胞抽提液制备：10μl全血冲入0.5ml生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水0.2ml混匀，加入95%乙醇0.1ml，振荡30s，加入三氯甲烷0.1ml，置快速混合器抽提1min，4000r/min离心3min，分层，上层为sod抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。

沉淀：准确量取上清液体积，加2倍体积95％冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀；

溶解：将沉淀物用0.1mol/L NaOH约10毫升溶解,得DNA溶液。

溶液I—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

亲和层析 电泳分离 蛋白纯品 精分离 粗分离 前处理 凝胶层析 生物体组织细胞 离心分离 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 蛋白质粗制品 蛋白质粗抽提液 组织粉碎 细胞裂解 蛋白释放 dna释放 离子交换层析 图3-3 蛋白质分离纯化的一般技术路线 （一） 技术路线的设计 蛋白质的分离与纯化 （二）分离纯化的总体原则 1、靶蛋白结构完整 严防降解和变性 2、靶蛋白的纯度要求 结构完整和高纯度才能达到高比活性目标。3． 1 硬化剂治疗机制囊肿壁内皮立方上皮具有分泌囊液的功能， 囊液中含有少量蛋白、 氯化钾、 胆固醇、 脱落细胞等， 将囊液抽尽注入硬化剂后， 可使内皮细胞的蛋白凝固变性， 细胞破坏失去分泌功能， 产生无菌性炎症，囊腔粘连闭合而不再复发。5.重组蛋白的复性将上述重组蛋白2次变性溶解液缓慢加入复性液(1mmol/ledta，1mmol/l还原型谷胱苷肽(csh)，0.1mmol/l氧化型谷胱苷肽(gssg)，20mmol/l tris-hcl，ph8.0)，在90min内降低尿素浓度至1.0mol/l，再一次稀释到0.1mol/l，复性物4℃过夜，然后用20mmol/l tris-hcl，ph8.0透析或超滤平衡去除复性剂。

溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？ 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

做蛋白质组学的前处理要用10%的tca/丙酮沉淀蛋白，之后用丙酮洗沉淀(沉淀要打散，不能呈块状)2~3次，离心去掉丙酮，剩余的一点点丙酮很容易就挥发了，立即加入蛋白质溶解液。是不是这个实验啊1、取1支试管,加入1ml卵蛋清溶液,再加入2%硫酸铜溶液1滴,观察沉淀生成.2、再向试管中加入过量的饱和硫酸铜溶液,观察沉淀的溶解.盐溶液（比如硫酸铜）使蛋白质沉淀的原因不是蛋白质变性而是盐析,少量的盐溶液改变了蛋白质的溶解度,所以在步骤一的时候,溶剂（水）的量相对不足,所以发生了沉淀,但是当加入足够。15. 沉淀的溶解◆ 生成弱电解质使沉淀溶解◆ 通过氧化还原反应使沉淀溶解◆ 生成配合物使沉淀溶解5. 沉淀的溶解◆ 生成弱电解质使沉淀溶解5. 沉淀的溶解◆ 通过氧化还原反应使沉淀溶解5. 沉淀的溶解◆ 生成配合物使沉淀溶解5. 沉淀的溶解（1）0.20 mol·l。

若洗脱液中磷酸浓度超过测定范围，可用洗脱液稀释后测定，计算时乘以稀释倍数。方法 250 ml样品中加入0.4 ml磷酸消除水中硫化物等干扰后，在氨水—氯化铵缓冲液提供的缓冲环境和有氧化剂铁氰化钾存在的溶液中，酚类与4-氨基安替比林生成红色安替比林染料，此 染料用氯仿萃取后比色定量。射流器安装在多路阀上，靠水流过喷嘴和喉管时产生的负压将盐箱内的盐液吸入到树脂罐内，再生用的盐液浓度由注入射流器的水流量及被吸入的饱和盐液量的比例来决定，在设计射流器时已通过计算使得在一定的工作压力(20-60psi)下，其注入树脂罐的盐液浓度在8-12%之间。

苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用

抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？

酚（phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4m的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收。还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。用作胶黏剂的稀释剂，还用于防冻剂、脱水剂等，无色透明液体，有似乙醇和丙酮混合物的气味，能与醇、醚、氯仿和水混溶，能溶解生物碱、橡胶、虫胶、松香、合成树脂等多种有机物和某些无机物，与水形成共沸物，不溶于盐溶液，常温下可引火燃烧，其蒸汽与空气混合易形成爆炸混合物。

为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？

当溶液中ph小于8时，加抽提液时，因而损失了这部分水相中的dna，使离心后的上层水相：1的氯仿与异戊醇即成）.1％，因而具有溶菌的作用，大都采用tris-hcl系统，使蛋白失去水合状态而变性，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。酚（phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4m的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收。还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。

苯酚：氯仿：异戊醇为什么要25:24:1？

酚（phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4m的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收。还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。用作胶黏剂的稀释剂，还用于防冻剂、脱水剂等，无色透明液体，有似乙醇和丙酮混合物的气味，能与醇、醚、氯仿和水混溶，能溶解生物碱、橡胶、虫胶、松香、合成树脂等多种有机物和某些无机物，与水形成共沸物，不溶于盐溶液，常温下可引火燃烧，其蒸汽与空气混合易形成爆炸混合物。

当溶液中ph小于8时，加抽提液时，因而损失了这部分水相中的dna，使离心后的上层水相：1的氯仿与异戊醇即成）.1％，因而具有溶菌的作用，大都采用tris-hcl系统dna抽提 饱和酚，使蛋白失去水合状态而变性，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。酚（phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4m的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收。还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。