一种从福尔马林固定标本中提取DNA的方法及应用

'徕卡cm1950冰冻切片机冷冻锤jq-201甲醛ar分析纯，500ml/瓶ml50010%中性福尔马林(500ml)组织标本固定ml500010%中性福尔马林(5l)组织标本固定ml1510%中性缓冲福尔马林固定液试剂瓶容量20ml,内装10%中性缓冲福尔马林固定液15ml，可直接全用,500瓶/箱hbml500环保组织无毒固定液(500ml)组织标本固定，环保无毒 hbml5000环保组织无毒固定液(5l)组织标本固定，环保无毒 gdy-201bouin氏固定液皮肤组织固定，500ml/瓶gdy-202戊二醛磷酸盐缓冲固定液组织超薄切片固定，2.5%gdy-203aff液组织标本固定jj-204t度酒精70%乙醇/75%乙醇/80%乙醇/95%乙醇jj-205无水乙醇*最常用的脱水剂，可与水已任意比例互溶。 1.3 实验方法 1.3.1 类胡萝卜素提取工艺 将玉米黄粉烘干后粉 100目筛，加入 倍量的复合萃取剂，反复浸泡提取至玉米黄粉呈白色，收集滤液，在旋转蒸发 器中真空浓缩至紫红色粘稠状，将其溶于食用油即 得脂溶性胡萝卜素。2、标本固定要及时，固定液用10％中性缓冲福尔马林溶液，固定液要足量，用量为标本体积的5倍以上。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种从福尔马林固定标本中提取DNA的方法及应用。

背景技术

福尔马林是常用的组织固定剂和防腐剂，具有渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快的优点，甲醛作为福尔马林固定液的主要成分，能够在较好地保持组织细胞完整性的同时快速杀死生物细胞并固定生物大分子。

自噬是一种细胞自我消化途径，能消除异常的细胞器和畸形的蛋白[28]质，并通过溶酶体消化多余的或不必要的细胞质内容物 。因为上述胶原蛋白等易受到uva、uvb以及臭氧或其他氧化因素的损伤，当真皮层的胶原蛋白因上述的各种原因被氧化、就像弹簧一样断裂，胶原蛋白断裂后，对表皮的支撑作用就消失，因此造成表皮会不均一地塌陷，所以说鱼尾纹只是氧化纹的一种表现形式而已。胶原蛋白等易受到uva、uvb以及臭氧或其他氧化因素的损伤，当真皮层的胶原蛋白因上述的各种原因被氧化、就像弹簧一样断裂，胶原蛋白断裂后，对表皮的支撑作用就消失，因此造成表皮会不均一地塌陷，所以说额头纹只是胶原蛋白断裂的一种表现形式。

基因探针用于基因诊断，利用dna分子杂交原理，可以鉴定被检测标本上的遗传信息。据已测序的上西早生柿etr5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,pcr扩增到2个etr5-uenishiwase基因片段.2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断.连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体psmak321的35s启动子和nos终止子之间,构建成uenishiwase-etr5基因的rna干扰植物表达载体.载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌eha101中.以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200 μmol/l的as及spc梯度筛选能有效提高转化率.转化植株经pcr检测得到7株阳性植株.。分析了灰斑古毒蛾核型多角体病毒(orgyia ericae nucleopolyhedrovirus,orernpv)ecor i-o 片段分子生物学特征,为研究egt基因分子特性和杆状病毒遗传改良提供科学依据.克隆和分析了orernpv ecor i-o 片段所包含的2个基因,并应用生物软件对orernpv蜕皮甾体尿苷二磷酸葡糖转移酶(egt)基因及其启动子进行了比对分析.结果表明orernpv ecor i-o片段包含egt基因和ol-129同源基因,在该区域中编码egt基因的开放阅读框(orf)由1 539个核苷酸组成,可以编码512个氨基酸,预计蛋白质分子质量为57.9 kda.orernpv和npvs之间的同源性为46%～89%,与白斑天幕毛虫核型多角体病毒(orgyia leucostigma npv,olnpv)egt基因同源性最高,达89%,与棉褐带卷叶蛾核型多角体病毒(adoxophyes orana npv,aonpv)同源性最低为46%。

虽然现有技术已经提出针对特殊材料的DNA的提取方法，但是这些方法从福尔马林样本中提取的DNA降解现象严重，无法作为模板构建物种基因组文库，不能满足现代分子生物学研究的需求。

CN101787364A公开了一种从陈旧福尔马林固定组织提取DNA的方法，所述方法利用微波热效应以水分子快速移除固定组织中的福尔马林，并消除福尔马林醛基引起的DNA-蛋白质交联，使DNA结构得以全部或部分恢复，从而获得较好质量的DNA。但是该方法以水分子替换组织中的福尔马林，会使标本大量吸水，容易造成细胞破裂。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种从福尔马林固定标本中提取DNA的方法及应用，所述方法采用中性缓冲液和梯度乙醇溶液浸泡标本，并将标本置于真空管中干燥，促进了福尔马林的置换和挥发，同时对标本进行加热，降低了DNA与蛋白质的交联程度，提高了蛋白酶K的消化能力，提取的DNA片段完整性好，可作为模板进行PCR扩增。

第一方面，本发明提供了一种从福尔马林固定标本中提取DNA的方法，包括以下步骤：

(1)将福尔马林固定标本依次浸泡于中性缓冲液和乙醇溶液中，随后进行真空干燥；

(2)将步骤(1)干燥后的标本浸泡于中性缓冲液中并进行加热；

(3)冷却至室温后，依次进行蛋白消化、DNA抽提、DNA沉淀和DNA洗涤，得到所述DNA。

5-ht主要经mao灭活生成5-羟吲哚乙酸（5-hiaa），而在松果体内，5-ht经羟基吲哚氧位甲基移位酶（hiomt）及芳香烃胺氮位甲基移位酶（aanmt）作用生成黑色紧张素（褪黑素），后者能抑制垂体促性腺激素的分泌。以植物、五谷粉末或液体食物，掺入工业用或药用的单一种(纯)的蛋白分解酵素供人食用，其不含有益活菌，也没有小分子生物能量，更没有消化酵素群，只含一种强性的蛋白酶(一般都用胰凝乳蛋酶)，食用后会破坏蛋白质的结构造成人体无法吸收，但却会造成消化功能增强的假象，长期食用会破坏消化道的黏膜和细胞组织，不但对健康无益，严重的话更会造成伤害。脂肪消化中的一大挑战是脂类不溶于水，而脂酶需要在水性环境中针对脂肪进行消化，胆汁酸（包括很多种，直接从肝中分泌的称为初级胆汁酸，经过小肠中细菌改变的称为次级胆汁酸）的一个中介特性让它在脂肪消化中不可或缺，它是双性分子，一端亲水，一端亲脂，起表面活性作用（肥皂去污靠的就是这个作用），可以把食物中的脂肪乳化间接地溶入水中，从而让脂酶起作用，在脂酶分解脂肪大分子以后，它又起把脂类小分子转运入血的吸收作用。

'徕卡cm1950冰冻切片机冷冻锤jq-201甲醛ar分析纯，500ml/瓶ml50010%中性福尔马林(500ml)组织标本固定ml500010%中性福尔马林(5l)组织标本固定ml1510%中性缓冲福尔马林固定液试剂瓶容量20ml,内装10%中性缓冲福尔马林固定液15ml，可直接全用,500瓶/箱hbml500环保组织无毒固定液(500ml)组织标本固定，环保无毒 hbml5000环保组织无毒固定液(5l)组织标本固定，环保无毒 gdy-201bouin氏固定液皮肤组织固定，500ml/瓶gdy-202戊二醛磷酸盐缓冲固定液组织超薄切片固定，2.5%gdy-203aff液组织标本固定jj-204t度酒精70%乙醇/75%乙醇/80%乙醇/95%乙醇jj-205无水乙醇*最常用的脱水剂，可与水已任意比例互溶。缓冲真空吸嘴缓冲真空吸嘴缓冲真空吸嘴。2、标本固定要及时，固定液用10％中性缓冲福尔马林溶液，固定液要足量，用量为标本体积的5倍以上。

'徕卡cm1950冰冻切片机冷冻锤jq-201甲醛ar分析纯，500ml/瓶ml50010%中性福尔马林(500ml)组织标本固定ml500010%中性福尔马林(5l)组织标本固定ml1510%中性缓冲福尔马林固定液试剂瓶容量20ml,内装10%中性缓冲福尔马林固定液15ml，可直接全用,500瓶/箱hbml500环保组织无毒固定液(500ml)组织标本固定，环保无毒 hbml5000环保组织无毒固定液(5l)组织标本固定，环保无毒 gdy-201bouin氏固定液皮肤组织固定，500ml/瓶gdy-202戊二醛磷酸盐缓冲固定液组织超薄切片固定福尔马林标本，2.5%gdy-203aff液组织标本固定jj-204t度酒精70%乙醇/75%乙醇/80%乙醇/95%乙醇jj-205无水乙醇*最常用的脱水剂，可与水已任意比例互溶。52．活体组织检查标本应用哪种溶液固定 a．70％乙醇 b．2％枸橼酸 c．2％碘酊 d．10％甲醛 e．5％新洁尔灭。2、标本固定要及时，固定液用10％中性缓冲福尔马林溶液，固定液要足量，用量为标本体积的5倍以上。

优选地，步骤(1)所述中性缓冲液为GTE缓冲液。

本发明中，GTE缓冲液的配方为100mmol/L氨基乙酸、10mmol/L Tris(pH＝8.0)和1mmol/L EDTA，中性GTE缓冲液代替水处理标本，用于福尔马林的置换。

优选地，步骤(1)所述乙醇溶液为梯度乙醇溶液；

优选地，所述梯度乙醇溶液的体积浓度分别为70％、80％、90％、95％和100％。

优选地，步骤(1)所述将福尔马林固定样本依次浸泡于中性缓冲液和乙醇溶液中，具体为：将福尔马林固定标本在GTE缓冲液中浸泡12-24h后，依次采用70％乙醇浸泡12-24h，80％乙醇浸泡2-4h，90％乙醇浸泡2-4h福尔马林标本，95％乙醇浸泡2-4h，100％乙醇浸泡1-2h。

优选地，步骤(1)所述真空干燥的时间为10-30min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min，优选为20min。

优选地，步骤(2)所述中性缓冲液为GTE缓冲液。

优选地，步骤(2)所述加热的温度为80-100℃，例如可以是80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃，优选为95℃。

优选地，步骤(2)所述加热的时间为10-30min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min，优选为15min。

优选地，步骤(3)所述蛋白消化采用蛋白酶K和/或二硫苏糖醇溶液。

本发明中，蛋白酶K的加入量与DNA的产量成正比，过量的蛋白酶K配合还原剂二硫苏糖醇提高了DNA的产量。

优选地，所述蛋白酶K的终浓度为5-10mg/mL，例如可以是5mg/mL、5.5mg/mL、6mg/mL、6.5mg/mL、7mg/mL、7.5mg/mL、8mg/mL、8.5mg/mL、9mg/mL、9.5mg/mL或10mg/mL，优选为8mg/mL。

优选地，所述二硫苏糖醇溶液的终浓度为0.1-1mmol/L，例如可以是0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L或1.0mmol/L，优选为0.6mmol/L。

为了方便使用者根据所需调节发热温度，所述主框5侧壁上优选安装至少具有两 个档位的温度控制按钮18，温度控制按钮18的档位根据实际需要可以设置两个档位、三个 档位等，以两个档位为例，一档是低温档，发热片温度在40度左右。1.4 热膨胀系数：ppr管线膨胀系数较大，约为0.15mm/m·℃，意即受外部温度（如冬夏季）或内部水温（冷、热水）变化时，有较大的变形量，由于ppr管为刚性直管，本身不能消化变形量，故易造成管路系统弯曲变形甚至漏水，而铝塑管因其与铝复合成整体，其线膨胀系数同铝相当，约0.025mm/m·℃，为ppr管的1/6，故受温度变化时，变形量较小，且铝塑管为柔性盘管，管道本身可以消化一定的变形量，不会造成管路系统的热胀变形。所述从气相产物中分离出氨气和含酚废水的方法可以为本领域常规的各种分离方法，例如，将从塔顶逸出的气相产物进一步冷却，冷却的温度以使水为液态，氨保持气态，优选冷却至50-90°c，进一步优选70-90°c，同时实现气液分离，收集得到氨气和含酚废水， 将氨气溶于水中即得到氨水。

2,一般,胃消化功能不好的人,症状是吃一点点就会饱,稍微多吃一点就会胃胀,特别在晚上多吃的话,还会因为胃部滞胀而影响入睡.硬的,纤维类的东西不好消化.因而建议少吃多餐,如果还没到正餐时间,可以补充一些食物,但不宜过多,一定要记住这不是正餐,正餐还是要按正常来吃.食物以软,松为主,一些比较韧性,爽口的东西不宜多吃,因为这些东西最难消化.汤最好饭前喝,饭后喝也会增加消化困难.入睡前两三个小时都最好不要吃东西,否则容易影响入睡,如果觉得肚子空可以多喝水.。本课教学设计没有按照课本的设计步骤，亦步亦趋地让学生根据课本的要求来认识蜗牛、了解蜗牛，而是发挥学生是学习、研究活动的主体的作用，将学习活动整体设计为“捉蜗牛、观察蜗牛——提出有关问题，讨论研究方法——研究蜗牛——汇报——延伸活动”几个阶段，从时间方面说，学生有了捉蜗牛的时间，有了观察蜗牛的时间，有了试验验证自己的新想法的时间，还有了讨论交流的时间，还有了诸如阅读、思考、记述等多种多样活动的时间。优选地，所述混砂步骤中的砂料是耐火砂或硅砂，所述粘接剂是占所述混合砂重量比为1.5 1.8%的低氮呋喃，所述固化剂是占所述混合砂重量比为0.45 0.72%的液态对甲苯磺酸。

优选地，步骤(3)所述DNA抽提采用酚-氯仿混合液和/或氯仿。

当溶液中ph小于8时，加抽提液时，因而损失了这部分水相中的dna，使离心后的上层水相：1的氯仿与异戊醇即成）.1％，因而具有溶菌的作用，大都采用tris-hcl系统，使蛋白失去水合状态而变性，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。将1.33克锌粉(20.4mmol)加到40ml无水二氧六环中，在氮气氛中搅拌下加入1.95克四氯化钛(10.2mmol)回流10小时，再加入1.45克维生素a醛(5.1mmol)的10ml无水二氧六环溶液，回流4小时，加入10%碳酸钾溶液及氯仿，分出有机层，经水洗、干燥、浓缩、柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1)纯化得1.10克β-胡萝卜素，总得率为41%(熔点为180-182℃)。dna溶液是dna以水合状态稳定存在，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，采用tris-hcl（pka=8，dna分子是带负电荷的，并在一定程度上能抑制dnase的活性、氯仿抽提再沉淀，必须把它去除干净。

优选地，步骤(3)所述DNA沉淀采用预冷的无水乙醇和醋酸铵溶液的混合液。