提取缓冲液pH值对植物组织中SOD、POD和CAT酶活性的影

黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 第 29 卷氧气是需氧生物所必须的物质，如果植物在生长过程中遭受到外界干旱、水淹、冷冻等环境胁迫，植物对光能的吸收效率会下降，体内 CO 2 固定受阻，最终 O 2 被作为电子受体形成 O 2 - 产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[1] 。活性氧过度积累对植物产生严重伤害，甚至死亡。超氧化物歧化酶（SOD） 催化 O 2·- 分解生成 H 2 O 2 ，胞内过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）能够清除 H 2 O 2 ，它们共同形成重要的植物活性氧清除系统[2-3] 。SOD、CAT 和POD 在生物学抗性研究中成为一个非常关键性的指标，为了提高植物的活性氧清除系统，人们采用改变水肥 [4-5] 、施用激素 [6] 以及转基因 [7] 等技术来提高植物的抗逆性。酶活性的测量有化学滴定法、比色法、电化学法和放射化学测定法等多种方法 [8-9] 。SOD、CAT和 POD 均可以通过比色法测定，测定方法简便易行被研究人员广泛采用 [10] ，三种酶在提取和测定时使用的缓冲溶液均可为磷酸缓冲溶液，仅 pH 值有差别。

为了进一步简化方法、减小误差、减少工作量，实验设计了不同 pH 的提取缓冲液体系，以研究提取缓冲液 pH 对酶活性的影响。1 材料与方法1.1 供试材料实验材料选取健康的大豆（嫩丰 18）、水稻（垦鉴提取缓冲液 pH 值对植物组织中 SOD、POD 和 CAT 酶活性的影响龚屾，石英，韩毅强，高亚梅，郑殿峰，杜吉到（黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319）摘 要：植物组织中 SOD、POD 和 CAT 活性测定对于研究植物抗逆性极其重要。植物提取液的颜色会影响sod活性测定吗为了简化实验，利用比色法研究了四种作物在正常水分条件下和干旱胁迫下，不同 pH 值提取缓冲液对 SOD、POD 和 CAT 酶活性的影响。结果表明，SOD 不适合在低 pH 值（6.0）提取缓冲液下提取，POD 不适合在 pH 7.0 的提取缓冲液下提取，CAT 可以应用三种提取缓冲液中的任意一种，对酶活性均影响不大。综上所述，SOD、POD 和 CAT 三种酶活均可以应用 pH 7.8 缓冲液提取，不会显著影响实验结果，提高测定效率。关键词：抗氧化；酶活性；超氧化物歧化酶；过氧化物酶；过氧化氢酶中图分类号：Q4-33/S-3 文献标识码：A 文章编号：1002-2090（2017）02-0008-05Effect of pH of Extraction Buffer on SOD ，POD and CAT in the Plant TissueGong Shen，Shi Ying，Han Yiqiang，Gao Yamei，Zheng Dianfeng，Du Jidao（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319）Abstract:Enzyme activity measurement of SOD，POD and CAT was important for study of plant stress-tolerance. To simplify theexperiment，effect of different extraction buffer on enzyme activity measurement of SOD，POD and CAT was analyzed in four cropsunder normal condition and drought stress by photocolorimetric method. Results showed that the extraction of SOD was unsuitable inlow pH （6.0）buffer，and the extraction of POD was unsuitable in pH 7.0 buffer，and the extraction of CAT could be carried out inthree buffers，which had no effect on enzyme activity of CAT. Above all，pH 7.8 buffer could be applied for extraction of SOD，PODand CAT，and had no obvious effect on result of measurement，and it would improve efficiency of activity measurement of thoseenzymes.Key words：Antioxidation；Enzyme activity；SOD；POD；CAT收稿日期：2016-03-26基金项目：国家自然科学基金项目（31271652）；大庆市指导性科技计划项目（zd-2016-041）。

作者简介：龚屾（1989-），男，黑龙江八一农垦大学农学院 2013 级硕士研究生。通讯作者：郑殿峰，男，教授，E-mail：zdffnj@263.net。doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.002第 29 卷 第 2 期2017 年 4 月黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University29（2）：8~12Apr. 2017第 2 期稻 10）、小麦（垦大 13）和玉米（郑单 958）种子。使用10 % 的双氧水浸泡 10 min，无菌水冲洗 3 次，播种于蛭石与土比例为 3∶1 的种植钵中，发芽 15 d 后，将各作物材料的 1/2 进行水分胁迫管理，另外 1/2 正常水分管理，处理 10 d 后，取长势一致，同一部位的叶片置于液氮中 30 min，保存于-80 ℃冰箱备用。1.2 酶活测定方法SOD 活性采用核黄素-NBT 法测定 [11] ，活性单位以抑制 NBT 光化还原 50％所需酶量为 1 个酶活单位（u）。CAT 活性采用紫外吸收法测定 [12-13] ，以每 min 内A240 减少 0.1 的酶量为一个酶活单位（u）。

POD 活性采用愈创木酚法测定 [14] ，酶活性计算：以每分钟 OD值变化（升高）0.1 为 1 个酶活性单位（u）。1.3 提取缓冲液和反应缓冲液的配方实验对照组为 SOD 酶活测定使用的提取和反应缓冲液是 50 mmol·L -1 pH 7.8 磷酸缓冲液 [11] ，CAT 酶活测定的提取和反应缓冲液使用的是 50 mmol·L -1pH 7.0 磷酸缓冲液 [12-13] ，POD 酶活测定的提取和反应缓冲液使用的是 50 mmol·L -1 pH 6.0 磷酸缓冲液 [11] 。实验处理组为反应液不变，提取液采用不同 pH 的磷酸缓冲液，设计如表 1。表 1 实验设计方案Table 1 Design scheme of experiment酶SODPODCAT提取液pH6.0pH7.0pH6.0反应液pH7.8pH6.0pH7.0提取液pH7.0pH7.8pH7.8反应液pH7.8pH6.0pH7.0提取液pH7.8pH6.0pH7.0反应液pH7.8pH6.0pH7.0处理 1/PBS 处理 2/PBS 对照/PBS1.4 数据分析用 Microsoft Excel 2010 软件录入数据和作图，采用 SPSS19.0 中 Duncan 检测进行差异显著性检验分析。

2 结果与分析2.1 不同 pH 磷酸提取缓冲液对 SOD 活性的影响利用不同 pH 磷酸提取缓冲液测定的 SOD 酶活性的结果见图 2，在正常测定条件下（pH 7.8），干旱处理的大豆、水稻和玉米三种作物的 SOD 酶活性均显著高于正常水分处理，小麦没有显著变化。磷酸提取缓冲液为（pH 7.0）时，变化与对照相同。并且不论正常水分处理还是干旱处理，四种作物的 SOD 酶活性均与对照无显著差异。但是，当磷酸提取缓冲液为（pH 6.0） 时水稻和玉米干旱处理和正常水分处理间的 SOD 酶活性变化不显著，小麦的出现显著差异，这些与对照（pH 7.8）不同。同时，小麦正常水分处理时磷酸提取缓冲液为（pH 6.0）测得的酶活显著低于正常测定条件下（pH 7.8）和 pH 7.0 处理；水稻的干旱条件下 pH 6.0 处理也显著低于其他两个处理。龚屾等：提取缓冲液 pH值对植物组织中 SOD、POD 和 CAT 酶活性的影响 9黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 第 29 卷注：不同小写字母表示具有显著性差异，显著水平 P＜0.05。植物提取液的颜色会影响sod活性测定吗图 1 不同提取液 pH 值对四种作物 SOD 酶活性的影响Fig. 1 Effect of different pH of extraction buffer on enzyme activity of SOD of four crops2.2 不同 pH 磷酸提取缓冲液对 POD 活性的影响研究发现磷酸提取缓冲液 pH 值为 7.0 时，四种作物两种处理的 POD 酶活性都低于正常提取条件下（pH6.0）POD 酶活性，其中大豆、小麦和水稻的 POD酶活性显著低于正常提取条件下（pH6.0）。

并且小麦中水分不同造成的差异也不相同。而当磷酸提取缓冲液 pH 值为 7.8 时，所有作物和的 POD 酶活性都与正常提取条件下（pH6.0）POD 酶活性无显著变化，同时干旱胁迫形成的差异与正常提取条件下（pH6.0）形成的差异相同。干旱条件下，大豆 POD 酶活性差异最大，小麦其次，水稻和玉米无显著变化。注：不同小写字母表示具有显著性差异，显著水平 P＜0.05。图 2 不同提取液 pH 值对四种作物 POD 酶活性的影响Fig. 2 Effect of different pH of extraction buffer on enzyme activity of POD of four crops10第 2 期注：不同小写字母表示具有显著性差异，显著水平 P＜0.05。图 3 不同提取液 pH 值对四种作物 CAT 酶活性的影响Fig. 3 Effect of different pH of extraction buffer on enzyme activity of CAT of four crops2.3 不同 pH 磷酸提取缓冲液对 CAT 活性的影响研究发现磷酸提取缓冲液 pH 值对 CAT 活性的影响较小，同种作物和同样的水分条件下不同 pH 值提取缓冲液对 CAT 活性无显著影响，并且两种水分条件下的 CAT 活性差异变化均相同，见图 3。

b、as进入水稻细胞，砷（as）可以富集在植物体内，转化为毒性很强的金属有机物，影响水稻的株高、根长和干重，则砷（as）可能是酶的抑制剂，与酶结合后使得酶的结构发生改变，失去活性，进而影响细胞代谢，故b正确。所以，综合考虑植物液除臭剂更领先一筹，植物液除臭剂是采用国际先进的植物提取技术,在丝兰、银杏叶、茶多fen、葡萄籽、樟科植物、桉叶油、松油等300多种植物提取有效成分为主要原料，配以对各种不同臭气分子的吸附分解原理而进行调配生产的一种除臭剂，主要用于各种恶臭环境的异味处理。探讨缓解根系腐解液自毒物质抑制番茄幼苗生育的方法.试验以珍珠岩基质进行盆栽试验,研究了珍珠岩基质中添加碳化玉米芯对番茄根系腐解液抑制番茄幼苗生长、光合作用及番茄叶片保护酶活性变化的缓解效果.结果表明:与对照相比,施用番茄根系腐解液对幼苗的生物量、叶绿素含量、光合作用指标均具有显著的抑制作用,番茄叶片的保护性酶活性在处理初期提高,随着处理时间的延长,pod和cat活性明显下降,同时显著增加了番茄叶片内mda的含量.在添加碳化玉米芯或活性炭可显著缓解番茄根系腐解液对番茄幼苗的毒害作用.与活性炭相似,碳化玉米芯具有显著缓解番茄根系腐解液自毒物质抑制番茄幼苗生长的作用.因此,番茄生产中施用碳化玉米芯可作为防止番茄连作障碍的措施之一.。

以往根据三种酶反应的最适 pH 设定相应的提取液的 pH[14] ，三种酶液的提取都是分开的，这为三种酶活性的测定增加了工作量。对实验的结果进一步分析发现，三种酶在提取缓冲液 pH 7.8 时可以获得较高的酶活性，可以准确测量。这样可一次提取三种酶的提取液用于酶活测定，减少提取次数，简化实验。作物干旱条件下，SOD 将 O 2·- 分解生成 H 2 O 2 ，而H 2 O 2 除本身对细胞有毒害外，还可在 Fe 2+ 、Mn 2+ 等的龚屾等：提取缓冲液 pH 值对植物组织中 SOD、POD 和 CAT 酶活性的影响 11黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 第 29 卷参与下，通过Haber-Weiss反应生成毒害更强的·OH [18] 。CAT 直接催化 H 2 O 2 分解为 H 2 O 和 O 2 ，而 POD 是一种以血红素为辅基的酶，通过催化 H 2 O 2 与有机无机氢供体发生氧化还原反应，以消耗 H 2 O 2 。它们在阻断自由基链式反应中还起着承上启下的作用。研究发现干旱条件下大豆中 POD 活性显著高于正常水分。而 CAT 活性没有显著改变，说明在大豆中 POD 在清除 H 2 O 2 能力方面强于 CAT。

颁奖词：它采用“微碳技术”，不仅为作物生长补充必需的矿质营养，而且通过提供酶类的催化因子而增强作物光合作用和呼吸作用，提高作物活性。探讨缓解根系腐解液自毒物质抑制番茄幼苗生育的方法.试验以珍珠岩基质进行盆栽试验,研究了珍珠岩基质中添加碳化玉米芯对番茄根系腐解液抑制番茄幼苗生长、光合作用及番茄叶片保护酶活性变化的缓解效果.结果表明:与对照相比,施用番茄根系腐解液对幼苗的生物量、叶绿素含量、光合作用指标均具有显著的抑制作用,番茄叶片的保护性酶活性在处理初期提高,随着处理时间的延长,pod和cat活性明显下降,同时显著增加了番茄叶片内mda的含量.在添加碳化玉米芯或活性炭可显著缓解番茄根系腐解液对番茄幼苗的毒害作用.与活性炭相似,碳化玉米芯具有显著缓解番茄根系腐解液自毒物质抑制番茄幼苗生长的作用.因此,番茄生产中施用碳化玉米芯可作为防止番茄连作障碍的措施之一.。磷在植物体内的运转速度应该是所有元素里面最活跃的，从叶片上形成atp以后要供给根系吸收营养和合成氨基酸的能量物质，这个时候将是很关键的，而硫是在光合作用上提高光合作用的速度，合成蛋白质同时使蛋白质有了酶的活性，酶的活性决定了整个有机体的代谢速度，一个为糖和氨基酸的合成提高能量，一个为蛋白质和酶的活性提高起了很大的作用，相互合作起到更好的膨大作用。