密度梯度离心法原理_蔗糖密度梯度离心法_密度梯度分离

在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。梯度液的密度随着离心本经的增大而增加。密度梯度可以予形成,也可以在离心过程中自形成,经常,密度梯度的可以分为：速率一区带(Rate-30nal)离和等密度(Isopycnic)离心。

在速率一区带离心中混合样品的以很薄的一层铺在梯度液的上部,在离心过程中由于不同组份"颗粒"在梯度液中沉降速率的差别,而在离心的某一时刻形成了数个含左第一级份颗粒的"区带"。离心过程在最垂"的样品(或者说沉降得最快的样品)形成沉殿前就停止了。样品在离心后与梯度液一起收集,用常规技术去除梯度材料后就得了某个较纯的成份。每个单一组份的沉降速率取决于它们的形状、尺寸、密度、离心力的大小、梯度液的密度和粘性系数。

对于相类似的生物体组份常常形状也相似。密度梯度分离在速率区带离心中我们常常使梯度液的最大密度不超过样品在该梯度中浮密度。利用这类生物组份在尺寸上的差异的形成的沉降速率的不同,选择某一特定时刻,当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停止离心即可以达到分离目的。

与速率一区带离心法不同的是,等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。混合样品可以铺在梯度液之上,也可以置于梯度液之下,甚至和梯度液混在一起。最后一种方法依靠离心力来形成梯度(自形成梯度)在形成梯度的过程中由于样品各单一成份向它们自己的等密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。对于速率一区带离心,梯度液最大密度一般小于样品中各组份的密度,也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉殿后来分离样品；而等密度离心法中,梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度,利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。密度梯度分离

密度梯度离心法的理论依据是每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为：

V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r

式中V是某一时刻样品的沉降速度(厘米/秒)

d：样品颗粒的直径(厘米),我们在初步计算时就假说样品颗粒为球体。非球形颗粒样品,可以以上式为基础进行修正。

σ：样品颗粒的密度(克/厘米3)

s：密度梯度液的密度(克/厘米3)

η：密度梯度液的粘性系数(克/厘米·秒)

ω：离心机重轴的旋转角速度(1/秒),ω=2πN÷60,N：转/分

r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离,即离心半径(厘米)

当

σ>S时V>0即样品顺离心力方向沉降

σ〈S时V〈0即样品逆离心力方向上浮

σ=S时V=0即样品停止沉降或上浮,"稳定"在这一位置

用这个公式可以很好地解释在速率一区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降(或上浮)行为。

梯度型式选择

离心时,溶液中各种组份都同时处在离心声中,被分离的组份及梯度材料的分子都在离心力作用下向离心管底部(甩平、角式)或外壁(垂直管、近垂直管、区带转头、连续流转头)沉降。对于梯度材料,如果它们的沉降速度在离心初始阶段远大于浓度扩散速度,那么就可以形成连续的密度梯度。这就是"自形成梯度"产生的基本原理。我们可以把被分离样品和梯度材料混合在一起离心,梯度材料去离心过程中形成密度梯度,而样品中不同组份则沉降(或上浮)到它们自己的等密度区。

另一种方法是预先制备好密度梯度,将样品铺在离心管(或区带转头)的某一部份(如离心管上部,下部或中部),离心,使样品中各种组份沉降(或上浮)到它们自己的等密度区前后,从而达到了我们所需要的"平衡"结果。

预先形成梯度可以是不连续的(阶梯型),也可以是连续梯度。阶梯型不连续梯度大多适用于从植物或动物组织的匀浆中分离整细胞或亚细胞器,或用于某些病毒的纯化。而连续梯度由于共密度平滑地变化,对于某些生物样品的多种成份组合的分离可以得到较低市制分辨率而得到了广泛的应用。

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