基因工程中Ca2+处理细菌是增加细胞壁还是细胞膜的通透性？

基因工程中，用CaCl2处理细菌，增加其通透性的是细胞膜还是细胞壁？

(2011-03-01 10:41:24)

细菌的细胞壁除支原体外，几乎所有的细菌都有细胞壁。细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，它使得这层壁坚韧并富有弹性。一旦失去细胞壁，所有的细菌都将变成球形。细菌细胞壁的主要功能是保护细胞、维持细胞形状、协助鞭毛运动等，而且还与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性有关。细菌的细胞壁是多孔性的，可容许水和一些化学物质通过，但大分子的物质不能通过

24.大肠杆菌感受态细胞制备的基本原理细菌处于0℃cacl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的dna形成抗dna酶的羟基－钙磷酸复合物粘附于细菌表面,经42℃短时间处理,促进细胞吸收dna复合物,将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得新的表型得到表达,然后将此细菌培养物涂在含有相应抗生素的选择培养基。b.置于低渗溶液中的细胞体积变大，能体现细胞膜的结构特点。 [创设情景9]：方式三、胞间连丝相邻两个细胞之间形成通 道，携带信息的物质通过通道进入另一个细胞，例如高等植 物细胞间通过胞间连丝相互连接，也有信息交流的作用。

47.基于分子大小的分离质粒dna的制备1细菌细胞在蔗糖存在时用edta和溶菌酶进行处理，可以防止细胞的立刻破裂2细胞壁被部分瓦解后形成残壁细胞，但细胞质膜仍然完好无损3利用非离子去垢剂和triton-100的诱导，防止细菌染色体断裂4离心后的裂解液上清即为质粒dna。 因为它们有光合色素藻蓝素和叶绿素 原核生物 放线菌 支原体 衣原体 生 物 体 非细胞生物: 细胞 生物 病毒 原核 生物 真核 细胞 放线菌：链霉菌 动物：变形虫 蓝藻：念珠藻，颤藻，发菜 蓝球藻 细菌：乳酸杆菌，醋酸杆菌，葡萄球菌 支原体：最小的细胞细胞膜选择性通透，没有细胞壁 衣原体： 真菌：酵母菌、青霉菌，曲霉菌、蘑菇 植物：衣藻，团藻 思考：。协助细胞运动和分裂脱壁的细胞称为细菌原生质体（bacterial protoplast）或球状体（spheroplast，因脱壁不完全），脱壁后的细菌原生质体，生存和活动能力大大降低。

肠杆菌感受态细胞的制备和转化

1、感受态细胞的概念

重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并

高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。

在原核生物中细胞膜选择性通透，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

于是，研究者提出，加热杀死的有荚菌培养物或其无细胞抽提物中，一定存在着某种导致细菌类型发生转化的物质，可是人们包括格里菲斯并没有认识到这其中已经包含了遗传物质的传递，只是为了便于研究，暂时叫做“转化因子”。能补充活化美白因子使全身美白因子的细胞更新，从而改善缺氧性暗亚、粗糙皮肤等一系列青春消逝现象，令全身肌肤由内至外白里透红、恢复弹性，现代医学研究表明，皮肤产生色斑和衰老变化的原因，在于细胞生理过程中产生的过氧自由基的作用，以及酪氨酸酶活性的增强。某生物dna片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑，或成活细胞）即为一个dna片段的克隆。

制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。

2、转化的概念及原理

在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，

使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

于是，研究者提出，加热杀死的有荚菌培养物或其无细胞抽提物中，一定存在着某种导致细菌类型发生转化的物质，可是人们包括格里菲斯并没有认识到这其中已经包含了遗传物质的传递，只是为了便于研究，暂时叫做“转化因子”。23.质粒dna转化加入cacl2溶液的作用1.0.1mol cacl2低渗溶液改变细菌细胞的形状，使细菌细胞膨胀成球形2.ca2+可能改变细菌细胞壁的结构，使细胞壁和细胞膜之间的蛋白质发生缺失3.cacl2能与外源dna之间形成羟基－钙磷酸复合物，使其粘附于细菌细胞的表面。c解析细菌都是单细胞的个体．细菌的基本结构有细胞壁、细胞膜、细胞质和dna集中的区域，没有成形的细胞核．没有叶绿体，因此营养方式是异养，必须依靠现成的有机物维持生活．（只有少数硫化菌以分解硫化物获得能量自养．）细菌是靠分裂进行生殖的，也就是一个细菌分裂成两个细菌．长大以后又能进行分裂．在环境适宜的时候，不到半小时，细菌就能分裂一次．6。

Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。

化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。

除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。

3、感受态细胞制备及转化中的影响因素

⑴、细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已

经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。

此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

⑵、质粒DNA的质量和浓度

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。

对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。

⑶、试剂的质量

所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。

⑷、防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。