激光共聚焦内镜_近场光学显微镜原理_共聚焦显微镜原理

实验三共聚焦激光显微镜的原理和应用

一.实验目的

1.让学生了解激光共聚焦显微镜的组成，掌握激光共聚焦显微镜常用的基本操作及注意事项。能够熟练、准确射击光路，重点掌握激光共聚焦显微镜测定细胞荧光信号动态变化的方法，了解激光共聚焦显微镜在生物学上的应用。

2.了解聚焦激光扫描显微镜的应用

二.实验原理

激光共聚焦显微镜是将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合一起的高技术设备。激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机一级图像输出设备等。

通过照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，激光光源经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上，对标本内焦平面上的每一点进行扫描，这样由焦平面上样品的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共聚焦图像。然后激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管(PMT)探测收集,并将信号输送到计算机。在这光路中，焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的，不能通过小孔，只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔被观测到。

在共聚焦显微镜的载物台上所加装的微量步进马达，可驱动载物台在扫描过程中按照设定步距移动，以使物镜聚焦于样品的不同层面上并采集该层的荧光图像，从而得到样品按照深度排列的各个横断面的一系列荧光图像。

若按照一定的时间间隔、重复地采集样品内固定区域的荧光图像，并对其进行定位、定性及定量分析，则可实现对该样品的实时监测。

三.实验仪器与材料

1.激光共聚焦显微镜

2.细胞：培养的成纤维细胞（3T3成纤维细胞或其他细胞贴壁细胞）

3.缓冲液：罗丹明（Rhodamine 123）母液（1mM）：将0.4mg Rh123溶解到1mL DMSO中制备成Rh123-DMSO母液，用培养基稀释母液至20µM Rh123缓冲液（工作液）；10%福尔马林缓冲液；PBS缓冲液。

4.盖玻片：厚度应小于0.17 mm，使用前需要用玻璃洗液浸泡处理一天以上，铬酸浸泡过夜，去离子水冲洗掉残存的洗液后,无水乙醇中浸泡待用，临用前在酒精灯上过火灭菌处理后。

四.实验步骤

（一）激光扫描共聚焦显微镜的结构特点

激光共聚焦显微镜主要由四部分组成（见图1）：

1.荧光显微镜光学系统：荧光显微镜作为激光扫描共聚焦显微镜的一个重要的组成部分，其主要是用于预览样品。通常荧光显微镜部分配备两个光源—卤素灯光源和汞灯光源。其卤素灯光源用于寻找样品焦平面、观察样品位置、形态和分布；其汞灯用于观察和分辨样品中产生荧光物质的成分和位置。对于光敏（例如猝灭）的样品最好用其光镜进行预览，以减少对样品的刺激。

2.扫描装置：有可动反光镜、分光器、pinhole及检测器等重要部件。检测器采用高灵敏度的光电倍增管（Photo Multiplier Tube; PMT）其检测的范围和灵敏度可根据样品的强度进行连续调节。将荧光图像的强度按照0－255分级显示。

3.激光光源：常用的激光谱线可以覆盖很多生物用荧光探针和用于日常荧光分析。目前通常采用的激光谱线有：Ar-458、476、488、514 nm；Kr-568 nm、647 nm；HeNe-543nm、633nm；Ar(UV)-351、364nm为紫外光；蓝紫光半导体激光器发出405nm的激光。

4.检测系统：整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活行。由于激光器在工作时散发大量的热，需要风扇降温，突然断电可能烧坏激光器，因此还需要配备稳压电源和不间断供电装备。

图3-1 激光扫描共聚焦显微镜工作原理示意图