藏獒分子标记的特异性引物及检测方法与流程(2)

2、DNA抽提：

2.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000rpm条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养液后吹匀。2．3．2接种前细胞的准备 a375细胞传代至对数生长期后收集所需细胞数瓶，pbs液清洗2次，经胰酶消化至细胞大部分变圆，倒掉消化液，加入高糖dmem培养液，1000转离心5rain，加入4mlpbs液重悬浮细胞后如上条件再离心一次。评测方法：使用4ml酪氨酸标准溶液(0.5mol/l)加入新鲜马铃薯颗粒汁液1ml，放入恒温摇床增加溶氧反应15分钟后，将2ml反应后的溶液装入离心管以12000rpm速度离心3分钟上游引物，取上清液体，将没有加入沐浴露的溶液和加了沐浴露的溶液进行对比。

二、藏獒特异单核苷酸及微卫星分子标记的挖掘

通过大规模基因组测序构建家犬群体基因组数据库，通过比较藏獒群体和其它家犬群体的基因组差异，鉴定藏獒特异的单核苷酸多态位点变异以及藏獒基因组受选择区域的微卫星位点。

三、特异性引物设计

用Primer 3软件设计单核苷酸和微卫星引物，引物退火温度控制在50℃以上。单核苷酸PCR产物长度控制在350～800bp之间，微卫星PCR产物长度控制在150～500bp之间。

8个单核苷酸多态位点TM-P1，TM-P2，TM-E，TM-M，TM-M1，TM-H1，TM-C，TM-S和1个插入缺失变异位点TM-H2的引物序列、突变类型、退火温度如表1所示。

表1. 8个单核苷酸多态位点及1个插入缺失变异位点的特异性引物序列、突变类型及退火温度

表中F表示上游引物，R表示下游引物。

8个微卫星位点CAST5,，CAST6，CAST7，CAST8，CAST9，CAST10，CAST11，CAST12的引物序列、核心重复、退火温度如表2所示。

表2. 8个微卫星位点特异性引物序列、核心重复及退火温度

表中F表示上游引物，R表示下游引物

四、单核苷酸多态位点引物及微卫星引物在家犬群体中扩增

利用本发明的单核苷酸多态位点引物及微卫星引物对100只家犬样本进行PCR扩增。PCR反应体系如表3所示：

表3.PCR反应体系

PCR反应程序如表4所示。

表4.PCR反应程序

五、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

1、试剂配制：

10×TBE：54.495gTris，27.81g硼酸，14.615gEDTA，pH调至8.0～8.2，定容至500ml(终浓度0.9mol/LTris，0.9mol/L硼酸上游引物，0.1mol/LEDTA)，高压灭菌，室温保存备用；

0.5×TBE：量取50ml 10×TBE溶液，加超纯水定容至1000ml，室温保存备用。2、制胶：

称取0.2g琼脂糖粉，加0.5×TBE定容至100ml(终浓度2％)，高温溶解，凝胶凝固。

3、电泳

1、单核苷酸PCR产物10μL，加入5μL 6×loading buffer，混匀后上样，电泳。电压120V/cm，恒压电泳40分钟。

2、微卫星PCR产物1μL，加入0.5μL 6×loading buffer，混匀后上样，电泳。电压120V/cm，恒压电泳40分钟。

4.1实验测试中的关键代码与各模块测试结果的分析与说明1 创建一个弹出式主菜单下面代码是其设计界面的代码. 文本框1是界面代码, 文本框2是获取键盘方向代码.效果如图2所示:文本框1文本框2图2图32 实现光标的上移和下移,其代码文本框3所示, 其效果,请对比图2和图3.文本框33 在循环链表里输入数据,其实现代码如文本框4所示,效果如图4所示.文本框4图44 进入约瑟夫环问题的数据处理.其实现代码如文本框5所示,效果如图5所示:文本框5图53 查看已储存的数据.其代码如文本框6所示,其效果如图6所示:文本框6图63 查看约瑟夫环问题的内容:其效果如图7所示:图74.2试验过程中所遇到的问题分析与解决问题一:在创建弹出式菜单时,光标的上移和下移,无法实现.解决方案:将弹出式菜单的教程重新看了一遍,里面的光标上移和下移,都是通过各个坐标来实现的,例如window 3,3,29,9 。13．一个实验小组做“探究弹簧弹力与弹簧伸长关系”的实验,采用如图a所示装置,质量不计的弹簧下端挂一个小盘,在小盘中增添砝码,改变弹簧的弹力,实验中作出小盘中砝码重力随弹簧伸长量x的图象如图b所示。根据单目摄像头的投影特征，建立了行车环境中目标纵向分布位置在摄像头中的成像几何关系，如图11a）所示，与此对应的真实车道线信息在空间坐标中的位置模型如图11b）所示，目标成像效果如图11c）所示。

六、单核苷酸PCR产物测序

1、PCR产物回收：

在紫外灯照射下，将目的条带切下，放入干净EP管中，按照通用“DNA产物纯化回收试剂盒”提供的步骤回收及纯化。

2、将回收产物作为DNA模板分别用正下游引物进行测序反应，反应体系如表5所示。

表5.测序反应体系

测序反应程序如表6所示。

表6.测序反应程序

3、纯化测序反应产物：

吸取30μL预冷的75％异丙醇，加入测序反应产物，混匀后于-20℃放置30分钟。

4℃环境下以3800rpm/min的速度离心30分钟。

弃上清，烘干测序反应产物。

加入75μL ddH2O，4℃放置2小时溶解。

4、测序：

通过ABI 3730测序仪进行测序。

七、等位基因型分析

八、利用seqman软件分析SNP位点的等位基因型

九、单核苷酸多态位点的遗传学参数计算

用plink软件计算等位基因频率、观测杂合度和期望杂合度；检测位点是否符合哈迪-温伯格平衡；评估位点在藏獒群体和其它家犬群体的分化程度，计算FST值。本发明用上述方法获得9个单核苷酸多态位点标记，各单核苷酸多态位点的遗传学参数如表7所示，所有位点均在藏獒和其它家犬群体间表现出高分化，并且都符合哈迪-温伯格平衡。

表7.单核苷酸多态位点在家犬群体中的遗传学参数

九、微卫星PCR产物长度测定

1、PCR产物变性：

吸取900μL Hidye放入EP管中，加入7.4μL的LIZ500分子内标，混匀后分装到96孔板，每孔加9μL混合液。

吸取1μLPCR产物加入分装好的Hidye混合液中

95℃变性10分钟

马上放入-20℃冷却5分钟

4℃放置2小时

2、PCR产物长度测定

通过ABI3730测序仪进行长度测定

十、微卫星位点的遗传学参数计算

用genescan软件读取每个微卫星PCR产物的长度；用geneAlEx软件计算等位基因数、群体分化系数Fst，哈迪-温伯格平衡；用Cervus3.0软件计算每个微卫星位点的多态信息含量。本发明用上述方法获得8个微卫星标记，各微卫星位点的遗传学参数如表8所示，所有位点均为高度多态性位点(多态信息含量>0.5)，并且都符合哈迪-温伯格平衡(P>0.05)。

表8.微卫星位点在家犬群体中的遗传学参数

十一、整合单核苷酸多态位点和微卫星位点信息聚类家犬个体

e亚太五号卫星12690h42300一组中开锁的蒙古国mnb时，发现节目马赛克现象非常严重，如图17所示，笔者刚开始还以为是信号质量不佳所至，没想到换．上2102s接收盒时却完全正常，如图1 8所示，再换上2104s2接收盒时又出现马赛克现象。(3)实验中用35s标记一定量的氨基酸，来培养某哺乳动物的乳腺细胞，测得内质网、核糖体、高尔基体上放射性强度的变化曲线如图甲所示，以及在此过程中高尔基体、细胞膜、内质网膜面积的变化如图乙所示。然后，将停止点30沿电子管20向上移动，并使用治具将停止点30上之卡勾33 的上端穿过齿形环12上的扣孔101扣装固定(如图6所示)，此时停止点30即被卡于电子管20上并与液位传感器主体10连接固定，组装完毕(如图2所示)。

图2.17个位点的聚类分析，假设有2个群体。

图3.17个位点的聚类分析，假设有3个群体。

以上所述的仅是本发明的具体实施例，方案中公知的具体参数等常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

<110>云南中科藏獒种质资源技术开发有限公司

<120>藏獒分子标记的特异性引物及检测方法

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<213> 人工序列

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TGCAAGGAGGAGGAAGAAGG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CTCCCAGTCTCTTGCCTCTG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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TGCAAGGAGGAGGAAGAAGG

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<212> DNA

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CTCCCAGTCTCTTGCCTCTG

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<212> DNA

<213> 人工序列

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CATTCAGTCAGCATTTCTGC

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<212> DNA

<213> 人工序列

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GGGCTGCAGGTTGCGAGGGT

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<212> DNA

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TTCTTACATGGCAGCTGGTG

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CTTTTCCCTGTGAGCTCTGG

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GCTGCAATCCACAATGAAGA

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GAGGCTTCAAATGCCTTGAG

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CATGCCTTAGGGGCAGTAAA

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CATGCCTTAGGGGCAGTAAA

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<212> DNA

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AGTCCCCAGAAGGTTCCATG

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