质粒作为载体的条件_pet质粒载体_质粒的名词解释

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产品介绍

pET系统是有史以来在大肠杆菌中表达重组蛋白的功能最强大的系统，也是现今原核表达方面使用最广泛的系统。该系统中，目的基因被克隆到pET质粒载体上，受强噬菌体T7转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。T7 RNA聚合酶机制十分有效：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过改变诱导物的浓度来降低表达水平。pet质粒载体降低表达水平常用以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。pet质粒载体用不含有T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可解决免因目的蛋白表达对宿主细胞的毒性造成的质粒不稳定难题。两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白都能得以最优化表达。

可选质粒

最经典的pET-28a, pET-30a和pET-32a质粒，应用最广，参考文献最多。

下表列出三个经典系列载体主要特性。其中命名后带有(+)的载体含有f1复制区，可以制备单链DNA，适合突变及测序等应用。

pET-28a: T7lac启动子，高效及严谨型控制表达水平；N端 His.Tag/T7.Tag融合标签，可利用His.Tag进行金属离子螯合层析纯化表达蛋白，也可利用T7.Tag融合标签进行基于抗体结合的亲和纯化；含凝血酶（Thrombin）蛋白酶切位点；

pET-30a：T7lac启动子；N端 His.Tag/S.Tag融合标签，可利用His.Tag进行金属离子螯合层析纯化表达蛋白，也可利用S.Tag融合标签进行亲和纯化及高灵敏度定量检测；含凝血酶（Thrombin）及肠激酶（Enterokinase）蛋白酶切位点；

pET-32a：T7lac启动子；Trx融合蛋白表达载体，帮助表达蛋白形成二硫键，增加蛋白溶解性及活性；His.Tag/S.Tag融合标签。

pET系统构建操作流程

重组质粒和菌株的保存建议

在实验室里保存重组菌株的时候，为了挑菌和传代方便，我们常用LB平板保存在4℃冰箱中，需要提质粒和表达接种的时候，就直接从平板上挑菌，但是这种方法对于重组质粒的稳定性不利，容易出现质粒丢失、表达水平不稳定、菌株退化乃至发生污染等情况。我们建议：

1、长期存放菌株和pET重组子应该存在甘油里，－70℃存放。但是要注意高浓度甘油(> 10%)会导致质粒不稳定。请尽量保持甘油浓度8％。

2、重组质粒不宜长期保存于表达菌株（带DE3的大肠杆菌）中，请尽量使用不能表达T7 RNA聚合酶的大肠杆菌菌株（非DE3的大肠杆菌），大提质粒也请选用非表达型菌株进行。

Novagen-the Gold Standard in Protein Expression

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