原位杂交技术操作_什么叫原位杂交技术_dna原位杂交技术(3)

硫酸葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。

杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0

1 mM EDTA、载体DNA/RNA (1 mg/ml)、探针(20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 -10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours

对于短链的寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、载体DNA/RNA (1 mg/ml)、探针(20 - 200 ng/ml)、5xDenhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours

杂交后的洗涤

杂交后进行非特异结合探针的洗脱，同时也可进行单链核酸链的酶消化。洗脱的严谨性可通过调节洗脱液中的甲酰胺浓度、盐浓度和洗脱温度。常规洗涤条件为含50%甲酰胺的2×SSC。但在实际的实验中发现，对于提高杂交检测的特异性，严谨的杂交条件比严谨洗涤更为有效。

5. 免疫细胞化学反应(报告分子标记的探针)

如果使用间接检测的方法，通常需引入免疫细胞化学反应进行酶免反应和底物检测。免疫检测前进行样品的封闭能防止检测时的高背景。如进行生物素标记的探针杂交和检测，在含Tween20 和BSA的PBS中进行封闭。

如进行DIG标记的探针杂交和检测，在含BlockingReagent的Tris-HCl缓冲液中进行封闭。如果抗原抗体的结合能不受高盐条件影响，检测时加入0.4 MNaCl将有助于防止背景染色。封闭后再进行抗体孵育反应，通常是在保湿容器中进行37°C 30min孵育(或室温2h孵育)。抗体结合后在含Tween 20的缓冲液中进行3次5–10 min的洗涤。

酶反应显色：使用POD和底物DAB/咪唑构成的显色系统、AP和底物BCIP/NBT构成的显色系统；酶免反应的检测灵敏度提高，成色后色原性物质的稳定性和定位功能更好。另外，AP还有一种用于荧光检测的底物HNPP/FastRed TR, 用于提高荧光检测的灵敏度。

6. 显微镜检测

POD和AP的底物显色反应后使用普通的显微镜镜检，且显色可永久保留。该检测手段能满足大部分研究的灵敏度需求。对于样品厚度较高或密度较大的情况，可使用相差显微镜进行镜检。

如使用荧光标记的探针，则在杂交和洗涤步骤后直接用荧光显微镜观察。荧光探针配合荧光显微镜的检测是进行多重探针检测的良好手段，检测时建议使用抗荧光衰减封片剂，以减缓荧光淬灭。DNA复染用的PI或DAPI可直接溶于封片液进行染色(40ng DAPI/ml; 100 ng PI/ml) 。

原位杂交实验文献参考：A Simplified In Situ Hybridization Protocol Using Non-radioactively Labeled Probes to Detect Abundant and Rare mRNAs on Tissue Sections

该文献对组织切片和FFPE样品的原位杂交检测步骤进行了详尽的探索和优化，简化了实验的操作步骤，并能在复杂样品的杂交实验中原位检测到低拷贝的靶mRNA表达（20~30拷贝/细胞）。原位杂交技术操作