一种重组质粒载体及其构建方法和应用(2)

其中，所述诱导型启动子位于多克隆位点5’端，所述多克隆位点位于萤火虫荧光素酶基因5’端，所述组成型低表达启动子位于海肾荧光素酶基因5’端。

1.2.1 酵母双杂交载体的构建: 利用pcr扩增的方法从成人肝cdna文库中获得hpo205和cytc编码基因的dna序列, 通过相应限制性内切酶酶切后, 与同样酶切后的含dna结合结构域(dna binding domain, db)的pdbleu空载体和含转录激活结构域(activation domain, ad)的ppc86空载体连接, 连接产物转化e.coli. jm109感受态, 相应抗性筛选(pdbleu: 卡那抗性。35.根瘤农杆菌与植物细胞的化学分子内共生原理1损伤植物细胞产生酚类物质，作为农杆菌的侵染信号2这些化学诱导物通过农杆菌的细胞膜活化毒区a和毒区g基因，诱导毒区的其它基因3毒区基因的活化作用于t-dna的加工和t-dna的转移4.t-dna进入植物细胞后，整合到植物核dna上5.t-dna在植物细胞中表达，产生冠瘿碱及植物激素6.农杆菌ti质粒上有转移型冠瘿碱分解酶基因，该基因启动合成各种酶，分解植物细胞产生的冠瘿碱作为唯一的碳源和氮源7.冠瘿碱促进农杆菌的附着，有利于ti质粒的结合转移，扩大侵染范围。通过 网站查找出hpo205和cytc基因编码序列, 针对基因的全长设计引物, 从成人肝cdna文库中成功扩增出相应的编码基因, 经酶切、连接、转化、鉴定后送测序, 结果表明pdbleu-grer、pdbleu-cycs、ppc86-gfer、ppc86-cycs载体构建正确, 这样成功构建出hpo205和cytc酵母双杂交载体(表, 图).。

作为优选，所述构建方法包括：

据已测序的上西早生柿etr5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,pcr扩增到2个etr5-uenishiwase基因片段.2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断.连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体psmak321的35s启动子和nos终止子之间,构建成uenishiwase-etr5基因的rna干扰植物表达载体.载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌eha101中.以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200 μmol/l的as及spc梯度筛选能有效提高转化率.转化植株经pcr检测得到7株阳性植株.。三、重组质粒ppgh-hxo i的构建1、用限制性内切酶bglii和bamhi双酶切重组质粒pgagz a a-hsa,回收约2.8kb的片段。二、制备重组菌-1i1、用限制性内切酶pmei酶切重组质粒ppink-lc-hsa，回收线性化的质粒。

其中，所述诱导型启动子位于多克隆位点5’端，所述多克隆位点位于萤火虫荧光素酶基因5’端，所述组成型低表达启动子位于海肾荧光素酶基因5’端。在连接各部件时，可根据质粒上对应的酶切位点进行相应的酶切并连接。

作为优选，所述诱导型启动子为来源于四环素操纵子诱导调控系统、脱皮激素类诱导系统、FK506调控系统、纳巴霉素诱导系统或RU486诱导系统；更优选地，所述诱导型启动子为Tet-responsivePtightpromoter。

作为优选，所述组成型低表达启动子为TK启动子。

所述重组质粒的制备方法具体如下:将用限制性内切酶bglii和bamhi双酶切重组质粒pgagz a a-hsa得到含有所述表达盒乙的片段(约2.skb的片段)插入重组质粒ppink-lc-hsa的bamhi酶切位点，得到所述重组质粒(重组质粒ppgh_hx01)。感谢tree_qd的指导,我再说一下我的实验设计:我是将一个150bp的片段连到一个11kb的载体上,现在载体中连有另一个1kb的片段,我是把这个1kb的片段切下来,连上我150bp的片段(没有现成的空载体).我是通过高保真酶从t载体上扩增,然后回收酶切了的pcr产物。（2）若对符合设计要求的重组质粒a进行酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据表中信息分析若采用bamhi和psti酶切，可得到种dna片段．。