[详解]吲哚乙酸氧化酶活性的测定

植物生理学模块实验指导

李玲主编

科学出版社吲哚乙酸氧化酶的测定方法

【实验目的】

学习用比色皿法测定吲哚乙酸氧化酶

【实验原理】

吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶懂得作用下，被氧化破坏失去活性。吲哚乙酸氧化酶活力的

大小可通过其破坏吲哚乙酸的速度表示，用比色法测定吲哚乙酸的含量。【器材与试剂】

1.实验仪器与用具

分光光度计、离心机、恒温水浴锅、天平、研钵、试管、移液管、烧杯

2.实验试剂

1mmol/L 2,4-二氯酚:称取16.3mg 2,4-二氯酚，用蒸馏水溶解并定容至100ml。

1 mmol/L氯化锰:称取19.8mg MnCl?4HO，用蒸馏水溶解并定容至100ml。22

1 mmol/L吲哚乙酸:称取17.5mg IAA，用少量乙醇溶解，用蒸馏水定容至100ml。

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n)3-(6-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-4-(6-吗啉-4-基-1h-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮从通过盐酸(在回流的thf中)对3-基-1h-吲哚-3-基)-4-(1-甲氧基甲基-6-吗啉-4-基-1h-吲哚-3-基)吡咯-2，5-二酮去保护，随后在乙酸溶液中回流进行制备。h)3-(1-甲基-6-硝基-1h-吲哚-3-基)-4-(6-吡咯烷-1-基-1h-吲哚-3-基)吡咯-2，5-二酮通过回流在乙酸和盐酸水溶液的混合物中的3-(1-甲氧基甲基-6-吡咯烷-1-基-1h-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-6-硝基-1h-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮(上述)进行制备。最早应用的是吲哚丙酸(indole propionic acid，ipa)和吲哚丁酸(indole butyric acid，iba)，它们和吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，iaa)一样都具有吲哚环，只是侧链的长度不同。

存。用时将1ml样品加入2ml试剂。

20 mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)

3.实验材料

同过氧化氢酶

【实验步骤】

(最好是较冷的三氯乙酸(tca)溶液,防止研磨时温度过 高使酶失活) ,研磨(用磨碎机磨) ,15000r/min 的冷冻离心机下离心 10 分钟,上清液为粗 酶液,用于抗坏...。min-1离心20min取上清得到粗酶液，采用冷冻干燥将粗酶液浓缩，用于纯化。取2ml灭过菌的一次性塑料注射器吲哚乙酸氧化酶，用注射器推杆将灭过菌的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度约为0.5cm，然后向注射器筒中加入te缓冲液浸透的葡聚糖凝胶g-200，制成简式离心层析柱，再置于10ml的离心管中，于高速冷冻离心机上以3000r/min离心20min，去除葡聚糖凝胶g-200中的te缓冲液，将离心层析柱再置于另一10ml的离心管中，在离心层析柱顶部加入50ul粗土壤dna/index.html'>dna，以10 min为周期于3000r/min离心，分别收集层析液。

1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的ph7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。 2)培养结束后，将发酵液于1000ormirtht:离心20min，取上清得粗酶液，冷冻、干燥、浓缩粗酶液至规定的浓度，取浓缩液过0.22 μ m有机系滤膜，过滤液用于进一步纯化酶。[0008]2)培养结束后，将发酵液于1000or mirt1冷冻离心20min，取上清得粗酶液，冷冻、干燥、浓缩粗酶液至规定的浓度，取浓缩液过0.22 μ m有机系滤膜，得上样:。

?恒温3. 吸取反应混合液2ml，加入吲哚乙酸试剂4ml吲哚乙酸氧化酶，摇晕。在黑暗条件下，置于30水浴中20min，使显色。

4. 将显色的反应液与分光光度计中测定530nm处的OD值。根据读数从标准曲线上查出相应的吲哚乙酸残留量。

5. 配制浓度从0~30μg/ml的吲哚乙酸浓度，按照上述方法，分别测定OD值，绘制标准曲线或计算直线回归方程。

【实验报告】

按照下列公式，计算不同处理的材料吲哚乙酸氧化酶的活力(μg IAA/g鲜重?h)。

-C)×10(C12

1/V×V×W×t/601-1吲哚乙酸氧化酶(μg ?g?h)=

式中，C为反应液中残留的酶IAA量(μg/ml);C为无酶提取液中的IAA量(μg/ml);V121为样品制得的粗酶提取液体积(ml);V为反应液中粗酶提取物体积(ml);W为测试材料鲜重(g);t为反应时间;10为反应液体积(ml)。

【注意事项】

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附录Ⅲ 实验报告参考格式表Ⅲ4-3实验数据处理 桥路 增量均值 实验应变值 理论应变值 误差（%） 单臂测量 半桥测量 相对两臂测量 全桥测量 串联测量 并联测量 五、纯弯曲梁正应力测定实验报告 学院（系...。如标本中待测物质含量过高（样本od值大于标准品孔第一孔的od值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。若洗脱液中磷酸浓度超过测定范围，可用洗脱液稀释后测定，计算时乘以稀释倍数。

【思考题】

反应混合液与吲哚乙酸试剂混合后，为什么要在暗条件下对IAA进行显色反应,

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