质粒提取原理及碱法(2)

+ t5 H w# F5 [9 e [0 s 反应，因此是理想的沉淀剂。加入的乙醇后，乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA失水聚合。一般实验中，是

本发明提供的无水乙醇的制备方法，通过控制合适的溶胀吸水工艺条件，使高分子吸水树脂在高浓度的乙醇中溶胀，直接吸收其中的水分，分离制备无水乙醇，主要技术方案是用高分子吸水树脂与体积浓度大于95%的乙醇混合，高分子吸水树脂与乙醇的质量比为1 6-1 2，在40°c-70°c温度下，恒温30min-150min使高分子吸水树脂溶胀吸水， 然后过滤出高分子吸水树脂，经再生后循环使用，测定滤出液乙醇的体积浓度，得到大于 99. 5%的无水乙醇。1.一种无水乙醇的制备方法，其特征在于，用高分子吸水树脂与体积浓度大于95% 的乙醇混合碱法提取质粒，高分子吸水树脂与乙醇的质量比为1 6-1 2，在40°c-70°c温度下，恒温 30min-150min使高分子吸水树脂溶胀吸水，然后过滤出高分子吸水树脂，经再生后循环使用，滤出液为体积浓度大于99. 5 %的无水乙醇。本发明涉及一种无水乙醇制备方法，用高分子吸水树脂与体积浓度大于95％的乙醇溶液混合，高分子吸水树脂与乙醇的质量比为1∶6-1∶2，在40℃-70℃恒温30min-150min后，过滤出高分子吸水树脂经再生使用，得到滤出液为乙醇体积浓度99.5％以上的无水乙醇，本发明的方法可以大量削减乙醇浓缩制备无水乙醇过程的能耗和废水排放量，并且设备简单，操作流程短，处理成本低。

(4) 加入氨水，形成[ag(nh3)2]cl配合物，agcl的溶解度增大5.6 沉淀溶解平衡一、溶度积与溶解度二、沉淀溶解平衡的移动1.同离子效应与盐效应2. 酸度的影响3. 分步沉淀4. 沉淀的转化5. 沉淀的溶解一、溶度积与溶解度1. 溶度积常数ksp2. 溶度积规则3. 溶度积与溶解度的换算难溶物微溶物易溶物0.1/100g水0.01g/100g 水1. 溶度积常数ksp物质的溶解度只有大小之分，没有在水中绝对不溶解的物质。 a.3.2.2 氯化物的鉴别 取约 0.2 g 试样，加 10 ml 水溶解，加硝酸银溶液即产生白色沉淀，此沉淀不溶于硝酸，溶于过量的氨水溶液中。（5）洗涤沉淀，应避免沉淀溶解，且能将沉淀吸附物冲洗去，可用乙醇﹣水混合溶液，如只用水，则造成葡萄糖酸钙溶解而损失，只用乙醇，不能将杂质全被洗去，。

时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水

- k0 A2 u+ r! V2 X3 h9 j) X 乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30min即可。但因为使用异丙醇时常0 k) s& B5 U* J$ {6 _4 U

把盐沉淀下来，所以较多的还是使用乙醇。3 s0 U: o9 Q) G) g) ~

6、 pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTris－HCl，1mmol/L EDTA，其中含 RNA酶 20ug/ml。在基因操作实验中，选择缓冲液的0 O# h# T$ M% H2 V

主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24)等

9 ~6 x7 R' o/ j# U# N# f 虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将4 c, M( M* R; O9 s# f# ~* s# W

与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓

8 L4 T; r5 Z" @ R 度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的

2 c' g) V2 W6 t) x1 l5 G 干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。酚与水有! C+ p* R6 m L$ ]

一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。

* f1 S- P3 q& ^7 q8 Z$ { 用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游

# T" a, Y/ H3 B 离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。6 E4 K; j: A* M9 j" B

7、 70％乙醇$ t/ N5 ?3 i v& |, w* V

试验步骤:

/ i) Q# j4 k) x. V+ q1、无菌操作台上,取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上以10000rpm离心1min，或者以40006 y* @8 W m8 N6 e

弃上清液，加入1 ml 25% 冰乙醇洗涤沉淀及管壁，4 ℃，12 000 r/min 离心5 min 。(3)用80g 离心2-3分钟,弃上清液.。四、重组蛋白二次变性纯化取第一次纯化的沉淀物用尿素缓冲液(12)(6-8mol/l尿素，1mmol/l edta，100mmol/2-me，20mmol/l naac(醋酸钠)，ph3.5-7.0)变性溶解，于4℃离心12000rpm×20min，离心弃不溶物，留上清液调整蛋白浓度为8-10mg/克备用。

2、沉淀中加100μl用冰预冷的溶液I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分混合（需要剧烈振荡）。室温下放置

D0 F/ J. C2 W# i6 V0 K 10min。

: m/ ]3 O: W6 b* _) R+ m3、加入200μl溶液 II(新鲜配置)，加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀（千万不要振荡），冰浴5 min 。

3 W; d* S4 Z3 L7 e% G8 e4、加入150μl预冷溶液III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴15 min 。

! j9 c6 T* d: Y5 m4 c5、微量离心机上以4℃，12000rpm离心15min，取上清液于另一新Eppendorf管中。8 ~; w& ~. q b' ?' f

6、上清夜中加入等体积酚/氯仿（1：1）混匀，微量离心机上以4℃，12000rpm,离心5min。{经验之谈：如果选用, g4 h1 j8 e4 I/ A

37．等体积酚/氯仿抽提dna，在有novagen pellet paint存在的情况下乙醇沉淀dna，70%乙醇洗沉淀。6)用等体积的酚-氯仿抽提―次，取水相并用sephadexg-100离心柱层析(参看第6章)将cdna同剩余的dntp分开，以2.5倍体积的95%冷乙醇沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。

用ph8.0，0.1mnacl条件酶切时，反应液发混，全部沉淀，切出的蛋白（约12kd）经尿素溶解，透析后，ph6.0不能挂上cm柱。还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。1.4 ct3蛋白纯度的鉴定分别取超声后ct3菌液、酶切之前的gst-ct3融合蛋白、酶切后的沉淀beads和上清ct3蛋白，经5×。

转化完全没有问题。仅供参考}

1 E& \) A& F j# x7、小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下层的有机相。% a8 e6 k- |7 ]4 }( W% O

8、小心移出上清于一新Eppendorf管中,加入2 /3倍体积异丙醇,混匀, 4℃离心12000g×5min。( r. X# Y- o" S- U3 G) P

9、上清夜中加入2倍体积的无水乙醇混匀，室温下放置5min－10min，以12000rpm,离心5min-15min。; w8 a j' M2 @3 _; J" S

沉淀用乙醇洗涤二次，然后在60～80℃下干燥，干燥后的沉淀装入石英舟中，在800～900℃下用h2还原，还原结束后，逐渐降温至400～500℃，改通氩气或氮气冷却至室温出料。 洗涤方法：用70%乙醇洗涤沉淀1-2次，离心沉淀dna。沉淀用乙醇洗涤二次，然后在60～80℃下烘干，干燥后的沉淀装入石英舟中，在800～900℃下用h2还原。

11、小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸上，使所有的液体流出。再将附着在管壁上的液滴除去。在除去管6 I, f, F! R) @+ ~& |

壁上的液滴时，可以用一次性吸头与真空管相连，用吸头接触液面。但在液体吸出时应当尽量使吸头远离核

- n3 i5 y2 g T9 V2 d( a z 酸沉淀。自然干燥或者真空抽干到看不到液滴最好。' y7 [5 Z* Z1 P0 H: A$ ^4 l& |; i

12、加入50μlTE缓冲液（PH 8.0 含20μg/mlRNaseA）溶解质粒粗提物，在-20℃保存。

1 u0 j9 p" q* M& [; [6 ?注意事项：

实施例9在常温下，向5ml浓度为3m硫酸钛溶液中添加浓度为2.0m的磷酸溶液，调ph值为3.0，即有白色的磷酸钛沉淀生成，经过滤、蒸馏水洗涤3次后，得到磷酸钛沉淀。②25℃时向50ml的sn2+、cu2+浓度均为0.01mol/l的混合溶液中逐滴加入na2s溶液，当na2s溶液加到150ml时开始生成sns沉淀，则此时溶液中cu2+浓度为_____________mol/l。取10ml上述制备好的晶种透明溶胶，将其加热至55℃后，将80ml浓度为300g/l的硫酸钛溶液加入进去，搅拌40分钟后，将该反应体系温度以5℃/min的速度加热至125℃恒温沸腾4.5小时，所得到的白色沉淀物过滤得到滤饼，蒸馏水洗涤滤饼直至用氯化钡溶液检验滤液不出现白色沉淀时洗涤结束。