芥子气暴露后动物体内生物标志物——DNA加合物的检测和代谢研究.pdf(2)

5+5 本耄小结………………………………………………………………………，9鑫一第六章实际应用——芥子气巾毒人员朦滚巾SM。DNA加翕物的检测……………，98．6．1 引言……………………………………………………………………………，98．6．2 试剂罱材料………………………………………………………………………．98。6．2．1主要仪瓣……………………………………………………………………．98．6．2。2 试蠢l…………………………………………………………………………………………………。，99—6．3 实验豁分………………………………………………………………………，9擎。6．3。l 溶液配制……………………………………………………………………．99—6．3．2 芥子气中毒人员样品采集………………………………+………………．。100．6．3．3 芥子气中毒人员临床诊断结果…………………………………………，100．6．3．4 芥子气中毒人员的旅液中SM-DNA热合物的检测……………………．。100．6．4 结果蒜讨论……………………………………………………………………一10I。6．4．1 莽子气暴露的溯源憷检测………………………………………………，101。

6。4．2 中毒人员尿液中SM-DNA搬台物的检测结果…………………………．．101。6．5 本章小结………………………………………………………………………．103。结论…………．．……………………………………………………………………………………………………．．104。参考文献……………………………………………………………………………………．106。Vl 万方数据博’Ij学位论文目录文献综述…………………………………………………………………………………一116．攻读博士学位期间发表学术论文………………………………………………………．126．个人简历…………………………………………………………………………………一134．致谢…………………………………………………………………．…………………．…………………………．．135．VlI 万方数据博’lj学位论文缩略词表缩略词表 万方数据媾l：学位埝文筵堕型壅。。———__————_—w———————_————————————Ⅷ——————_——————…w————_——————————————————一一一————————————————————————————————————————————————————————一minMinute分锋1一甲基躐磺戬萋一2一(2一甲MS转MTE 1-methylsutfinyl．2．【2．(methylthio)ethylsulfinyl]ethane硫鏊乙鏊磺酰蒸≥乙烷N3．(2．羟乙基硫代乙藿)N3-HETEAN3。

【2．【(2一hydroxyethy)thio]一ethyl]一adenine腺嘌呤NT-HETEGN7．(2．麓乙墓硫代乙基)N7。【2。[(2-hydroxyethy)thio]一ethyl]一guanine鸟漂岭dinucleotideN烈>}Nicotinamideadenine越酰胺腺嗓岭二核替酸06-HETEG06．(2．麓乙基硫代乙基)06。【2。[(2-hydroxyethy)thio]一ethyl]一guanine鸟嘿岭ADP-ribose聚(ADP，核糖)聚合酶登燃POlypolyaneraseParttrillion百亿分之…pptperReactive滔性氧簇爻0Soxygenspeciesstandarddeviation翱对标漆偏差RS矜RelativeSBMS嚣1，1’．磺靛鍪．二(2．甲硫1，1'-sulfonylbis[2一(methylsulfiny)ethanel纂)乙婉SBMTE1，1’．磺虢基．二(2一甲基1，1'-sulfonylbis[2一(methylthio)ethane】磺虢基)己烷S释SANEl，o磺酰基一二f2一S一(N一l，l’．sulfonybis[2．S，心一acetylcysteinyl)eyhane乙酰半胱氨酸))乙烷SDSDSprague—DawleySMSulfurmustard芥子气Sp慧extraction阑楣萃取Solid-phaseTBpMSchlorideN．《叔丁基二甲基戳)制一甲Tert-butydimethylsilyl恭三氟己醚胶麟Thiodiglycol虢二甘醇TDGOsulfoxide硫■甘醇堑飙ThiodiglycolUPLC-MS／MSliquidchromatography趣赢效液褶惫谱一率缀矮Ultrahighperformance．2． 万方数据搏I：学位论文堡堕型查———————————————————————————————————————————————————————————————————一一一tandemmass瞄spectrometryUVUltraviolet紫外ValValine缬氨酸WWIWoridWarI第一次世界大战WWIIWorldWarII第二次世界大战．3． 万方数据 博I：学位论义摘要摘要芥子气，英文全称sulfur C4H8chs，是双功能烷基化试剂，也是糜烂性化学战剂中最为重要的--,oe。

芥子气 制备过程简单，毒性大且持续时问较长，在战争中被数次使用，至今仍然威胁着 世界和平和人民生命安全，有着“毒剂之王”之称。然而，芥子气的化学性质决定了 其毒性具有广泛性，目前国际上关于其针对性解毒药物的研究进展缓慢，临床救治也多将其视作烧伤处理。因此，深入研究芥子气的毒理作用机制、筛选和开发 其对抗特效治疗药物和临床医学干预方案具有重要现实意义，而这些亟需建立可靠的芥子气溯源性检测和毒理学评价方法。长期以来，国内外学者对芥子气毒理作用机制的研究不断深入，并提出了一系列理论。虽然目前仍未得出确切结论，但是各国学者普遍认同芥子气对DNA分子的烷基化损伤是其毒理作用的始发机制以及细胞毒性与生物毒性的物质基础。因此DNA烷基化损伤及修复过程中产生的内源性与外源性标志物可视为芥子气暴露后生物体损伤及恢复情况的有效评价指标。论文采用新兴的分析毒理学相关方法，通过检测芥子气与DNA的烷基化加合物(以下简称SM．DNA加合物)在体内的时效与量效变化趋势，实现对DNA的受损及修复过程的实时监控，从而定量阐述芥子气细胞毒性的物质基础与其毒性之间的相关性。现有文献报道最主要的SM—DNA加合物有以下四种：N7．(2．羟乙高，妒一HETEA是腺嘌呤上唯一烷基化产物，而根据碱基配对原则，Bis—G与06-HETEG的反应位点可直接破坏DNA双链结构等。

因此同时分析这四类加合物就可以全面监测DNA分子的烷基化程度，获得芥子气暴露后DNA的损伤及修复情况，进而为评价救治方案提供可靠技术方法。论文首先建立了同时检测生物体内不同功能组织以及尿液中四种SM．DNA加合物的同位素稀释超高效液相色谱串级质谱(ID—UPLC．MS／MS)分析方法；其次，建立合理的芥子气皮肤染毒的实验动物模型，取其组织器官和尿液；最后，利用建立的分析方法监测SM—DNA加合物在生物体内不同脏器的时效、量效分布，以便全面了解芥子气在生物体内从局部到整体的分布与代谢规律。论文共分六章。 万方数据簿l?学位论文摘要第一章为前言，简要介绍了芥予气的相关理化性质，主要阐述其在体内的代谢途径和毒理机制的研究现状，重点介绍芥子气对DNA分予的损伤枫理及蒸后续影响黻及SM．DNA加合物的各种检测手段，提&研究毽标和研究蠹容。分析测定方法。出于组织中SM。DNA连接在DNA分予上，为结合态加合物，导致样品前处理过程相对复杂。经过一系列的优化过程，该分析方法采用“酶解蛋白一酚氯仿抽撼～乙醇沉淀”法提取DNA分子，圈收率较高；挈酸加热法承解碱基，聪蔫∞．UPLC-MS／MS进行分析。

方法醺收率淹83．118％，检测限为0．02。0．重ng／mL，定量限必0。05—0。2ng／mL。本章对组织匀浆、DNA提取到碱基水解等全过程进行详细、系统的优化，建立了离效、稳定的检测方法，为下一章各脏器中DNA损伤的研究提供技术支持。第三章建立了不同剂量下SD大鼠芥子气皮肤染毒的动物模型，对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰脏、肾脏、全脑等主要组织中SM-DNA加合物进行检测，并对其中变纯最显著的组织进行了系统的时效、量效关系研究，全面的考察了不嗣暴露剂量的条件下，芥予气对不嗣功能的脏器组织中DNA分子的损伤情况及其自身修复的过程。实验结果表明SM—DNA加合物与染毒剂量和时间之间存在良好的量效、时效相关性；第一次系统证实了体内各脏器组织中Bis-G是李度魄锱占第二位的DNA<0．1％；)，揭示芥子气对DNA的损伤在前期研究中被严重低估；染毒剂量增加时，肺脏所受的损伤更为严重；肝脏可能并不是芥子气损伤的主要器官；发现脂类含量高或被脂肪包裹麓组织中SM-DNA翔合物含量楣对较高，提示我们芥子气可畿存在体内“蒡鬟魏蓄积”的闻题；芥子气可以迅速透过盘脑孱障，脑中脂类含量高，更易吸收并储存亲腊性的芥子气原型分子，导致单佼DNA形成加合物比例高。

骨髓是人体的造血中枢和免疫核心，是人体生命活力的源泉之一，骨髓里有丰富的干细胞（生命活力很强的备用细胞），是人体对抗疾病，修复创伤，替换衰老细胞的预备队。蛤蟹蛤蟹身和尾的醇提物均可加强豚鼠白细胞的运动力、肺和支气管吞噬细胞对细菌的吞噬功能和腹腔吞噬细胞的吞噬功能，蛤蟹提取物能显著增加小鼠脾重，并能对抗强的松龙的免疫抑制作用，还能提高小鼠静脉注射碳粒的廓清指数，提高正常小鼠免疫后血清的溶血含量，蛤蟹尾醇提物能增强血清中溶菌酶活性，提高抗体效价和提高小鼠淋巴细胞转化率，蛤蟹体仅能提高溶菌酶活性和抗体效价，而头则无明显影响。免疫系统由免疫器官(骨髓、脾脏、扁桃体、淋巴等)、免疫细胞(淋巴细胞、中性粒细胞、树突状细胞等)、以及免疫因子(免疫球蛋白、肿瘤坏死因子等)组成，是人体抵御病原菌侵犯的最重要的保护、防御系统。

本部分开发了固相萃取新方法，用于尿液中四种SM．DNA加合物的同时提取。优化ID．UPLC．MS／MS方法，回收率达到87．116％，检测限为2．5pg／mL，定量限为5．10pg／mL，实现了对加合物的高灵敏检测。建立了芥子气皮肤染毒的动物模型，并对尿液中SM．DNA加合物进行分析检测。结果显示了良好的时效、量效关系曲线，并且获得了尿液中四种SM—DNA加合物的真实比例关系。从宏观上监测DNA损伤的全身代谢轮廓，与组织中结果进行比较，发现二者在时效关系以及加合物含量关系方面整体趋势相同，可以实现良好的相互验证。由于尿液检测无痛、无损，而且对于SM．DNA的检测可以一定程度的反映机体DNA损伤情况，可作为芥子气溯源分析以及损伤效应监测的理想检测对象。第六章是本论文建立方法的实际应用。我们得到了四名意外接触芥子气患者的加合物的同时定量检测。检测结果表明尿液中四种SM．DNA均可检出，不仅更进一步确证芥子气染毒，而且发现加合物的含量与患者的暴露程度和临床中毒症状相互吻合。上述结论证明SM—DNA加合物可以作为理想的芥子气溯源性生物标志物。关键词：芥子气，DNA加合物，代谢，高效液相色谱一串联质谱联用技术 万方数据AbstractnameSulfurHD，chemicalmustard(SM，U．S．CodeasanknownmolecularformulaC4H8C12S)，isimportantchemicalwarfareofitseaseofvolatility,andvesicantagent．Because preparation，lowinWarsandhasbeenusedconflicts，alackofmilitaryso·calling“kingantidotes，SMofthechemicalwarfarethreatenedthe safety．continuallypublicagents”，whichforsulfurextensiveisnoantidoteitstoxicity,therespecificHowever,consideringasburn insufferedfromSMhavebeenalmosttreated mostlymustard，andpeoplethemechanismaswellisfortheresearchof toxicologyclinic．Therefore，itnecessaryastheofonareliableandsensitivetherapeuticdrugSM，which，certainly,dependsforthedetectionandevaluationofSM．method traceability toxicityanalysistheresearchintoSMforaseriesofDespitedecades，and theorybeingdeveloped，zhikuquan20150721onisthatthethereisnoexactconclusionconsistentlyit．However,itwidelyacceptedeffectontheofDNAsinvivocontributestothemostlesionSMdestructive alkylationandthematerialbasementofitsandmechanismbiologicaltoxicitycytotoxicity,thatDNAshavetowardsaresult，consideringlargesusceptibilityalkylatingagents．AstheofDNAandbiomarkersfromalkylatedendogenousexogenous generatedprocessdetectedasindexestoindicatethesituationlesionandwouldbesignificantrepairmenofafterorganismexposure．Sincetheofthesisresortedtoitsquantificationtoxicology,thisdevelopmentresearchedontheandtimeofthesefourdistribution，dosespirit，andrelationshipthereal-time ofDNAlesionkindsofSM．DNAadductsinrealizevivo，andmonitoringandthebetweenthematerialbaseofSMrelationshipcytotoxicityrepair,toexplaintothemainonDNAanditsresearch，thetoxicity．Accordingpreviouspositions．7一 万方数据簿|?学位论文AbstractmoleculeofSMaretheofandN3ofalkylatingN7，06positionguanine positionadenine，Until kindsofSM—DNAadductshavebeenandnow,fourrecognizedasbiomarkers，i．e。