例析pBR322质粒的特点

试题研究：在做基因工程试题时，碰到最多的是载体质粒，它的名称多种多样，这是什么原因呢？最常见的试题中出现的是pBR322质粒，它有什么特点？

pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。

一、人工质粒的命名规则

《国家高速公路网命名和编号规则》规定，国家高速公路命名规则为：首都放射线、纵线、横线名称，由路线起讫的地名中间加连接符“—”组成，编号由字母标识符汉语拼音“g”和阿拉伯数字编号组成。属名 （斜体，首字母大写）＋种加词 （斜体，全部字母小写）＋种命名人名字（正体，首字母大写）＋变种（亚种，变型，栽培变种）符号 var. （subsp. f. cv.）〔正体，所有符号小写〕＋变种（亚种，变型，栽培变种）加词〔斜体，全部字母小写〕＋变种（亚种，变型，栽培变种）命名人名字〔正体，首字母大写〕。美军战机代号一般有状态代号、 任务变更代号(一般用英文字母表示) 、 机种代号(一般用一个大写英文字母表示) 、 序列代号(用数码表示) 、 改型代号(按英文字母顺序编排 ,有的没有)等五种 ,较其它国家战机的命名复杂 ,所以翻译美军飞机时 ,务必明白各种代号的涵义。

5.对于主线编号后面跟了字母e或w或s或n的高速，就是主线的并行线，并用这四个字母来代表并行线相对主线的位置，e代表东（east）、w代表西（west）、s代表南（south）、n代表北（north）。zoso（jimmy page的纹章）)会称为zoso是因为这个符号看起来就像是这四个字母，这四个难以理解的符号最早出现在摇滚团体led zeppelin的唱片封面上，每个乐团成员选择一个个人的代表符号集合为封面，而这个符号被jimmy page选择为他自己的代表性纹章。该dna分子的酶切图谱正确的是()二、非选择题(共50分)21．(10分)如图为转基因生物培养示意图，据图回答问题：(1)图中a表示目的基因，研究人员需要用________酶获得它，还需采用____________技术对其进行扩增，然后将目的基因与质粒等载体组合形成了图中的________(填字母)。

8、jis机械结构用钢牌号表示方法为：机械结构用钢牌号表示方法为：、s+含碳量字母代号（c、ck）其中含碳量用中间值×100表示，字母c：表示碳k：含碳量+字母代号，其中含碳量用中间值表示，含碳量字母代号（、）其中含碳量用中间值×，：：表示渗碳用钢。单位矩阵、转置符号“t”，对角符号“dig”，单位符号（如m，n等）、表示图号和公式编号的字母用正体，例如图1（a）等。 9a表示（） 45.6b表示（） 45.6b – 9a表示（） 9a + 45.6b表示（） * * let’s… 4.用字母表示数量关系 2.用字母表示运算定律 1.用字母表示数 3.用字母表示计算公式 你还见过生活中哪些 用字母表示数的例子。

二、质粒载体pBR322的特点

1．相对分子质量较小，质粒载体pBR322的大小为4361bp（有说4363bp）。

2．带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。

3．具有两种抗生素抗性基因－氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。

4．具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。同时，由于其为人工构建质粒，虽然带有抗药性基因，但已不能在自然界的宿主细胞间转移，同时应用安全菌株，亦不会引起抗生素抗性基因传播。

三、典例分析

pBR322

是一个由普通质粒经过人工添加许多限制酶识别序列而构建的重要质粒，有万能质粒之称，图甲是pBR322结构示意图（ampr表示氨苄青霉素抗性基因，tetr表示四环素抗性基因）。图乙表示几种限制酶识别序列及其切割位点。回答下列问题：

（1）质粒是基因工程中常用的工具，其作用是 。人工构建pBR322过程中需要的酶是 。

构建共表达o型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,fmdv) 衣壳蛋白前体p12a和蛋白酶3c的重组杆状病毒,为进一步研究fmdv 空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础.从质粒t-op1中扩增出编码o型fmdv衣壳蛋白前体的p12a 基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pfastdual-3c的ph启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pd-p12a3c.通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒b-p12a3c,转染sf9细胞,获得表达o型fmdv衣壳蛋白的重组杆状病毒.重组杆状病毒经增殖并感染sf9细胞后,通过双抗体夹心elisa方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表达.结果表明,表达产物能被o型fmdv阳性血清识别,具有一定的反应原性,表明重组杆状病毒构建成功,该研究为o型fmdv空衣壳的体外组装及基因工程亚单位疫苗的研究提供了前期材料.。利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计合成引物,从菊苣叶绿体基因组中扩增包括rps7-rps12-trnv-16s-rdna基因在内的一段序列(genbank登录号为gq199478),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段.以叶绿体基因强启动子prrn驱动选择标记基因aada及报告基因gfp构建多顺反子表达盒prrn-aada-gfp-psba-3′,然后将表达盒克隆进菊苣叶绿体同源片段中,获得菊苣叶绿体定点整合表达载体pjag,酶切分析证明所构建的载体符合预期设计.该载体的构建为建立菊苣的叶绿体转化体系奠定基础,为进一步通过叶绿体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良,或以菊苣叶绿体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台.。于月华等(2014)利用 rt-pcr 技术从小麦中克隆了 dreb 基因，并以 pmd18-t-dreb 质粒为模板，pcr 扩增 dreb 基因片段，构建了该基因的植物表达载体。

（3）由图乙可知，经Sau3AⅠ酶切割得到的目的基因可以与被 酶切割的pBR322连接成重组质粒，原因是 。

我们以含人masp1、masp2全长编码区cdna的pgem-masp1、pgem-masp2质粒为模板，设计引物，扩增出入masp1和 masp2的c端基因片段，将其分别克隆至pet-17b质粒中，经pcr及基因测序鉴定序列正确后，导入大肠杆菌bl21(de3)，在氨苄青霉素抗性 的筛选培养基上获得了表达目的基因的pet17b-masp1c和pet17b-masp2c重组大肠杆菌，以iptg诱导其表达masp1- c/his、masp2-c/his融合蛋白，经sds-page鉴定证明融合蛋白存在于包涵体中。重组质粒上有标记基因，并不是转入农杆菌才能筛选，而是用农杆菌转化法，有利于重组质粒导入受体细胞。正如酵母穿梭载体一样，最初的操作在大肠杆菌中进行，把要克隆的基因插入pbin19，筛选出重组体，再转化进根瘤农杆菌，最后进入植物细胞，成功转化的植物细胞可在卡那霉素的平板上筛选出来。

答案：

（1）作为载体，将目的基因送入细胞；限制酶和DNA连接酶

（2）DNA双链复制；一段已知目的基因的核苷酸序列

（3）BamHⅠ；两种酶切割后产生的片段具有相同的粘性末端

（4）氨苄青霉素；平板上长出的菌落有的含有质粒，有的含有重组质粒

解析：本题主要考查基因工程的应用。

（1）在基因工程技术中，质粒是一种很重要的基因运载载体，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，在基因工程中其作用是作为基因运载载体，将目的基因送入细胞。人工构建pBR322过程中需要的酶是限制酶和DNA连接酶，用于切割目的基因和质粒，然后再把切割后的目的基因与质粒连接在一起。

从基因分离克隆的方法进行分类可分为三类：一种类型是功能克隆，即根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡聚核苷酸探针。同正链序列相同引物（primer）在聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，是某一个序列／碱基相对于另一个序列／碱基而言。特别是近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用。

（2）构建的重组质粒用bamhⅠ和ecorⅠ双酶切后，得到预期的2个片段4.4kb和1kb，分别表示质粒ptrchis a和megalin基因3189-4169。（2）从上图可知，某个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失，正常基因该区域上有3个酶切位点，突变基因上只有2个酶切位点。38.基因组文库：用适当的方法将某一生物细胞的整个基因组dna切割成大小合适的片段，并将这些片段与适当的载体进行体外重组，在引入到相应的宿主细胞中进行扩增，从而形成含有重组dna分子的群体，由于这些重组体包含有整个基因组dna序列，即包含了某种生物细胞的全部基因，因此称为“基因文库”。

（4）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，因为质粒上带有氨苄青霉素抗性基因，故应在筛选平板培养基中添加氨苄青霉素以筛选出重组细胞。需要进一步鉴定才能筛选出含有目的基因的大肠杆菌的单菌落，原因是平板上长出的菌落有的含有质粒，有的含有重组质粒。

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