MS对寡核苷酸的序列分析

第 29卷第 5期1997年 9月生物化学与生物物理学报ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICAVol. 29, No. 5Sep. , 1997MALDI-TOF-MS对寡核苷酸的序列分析阎庆金*杨松成蔡耘( 军事医学科学院国家生物医学分析中心 , 北京 100850 )王升启朱宝珍( 军事医学科学院放射医学研究所 , 北京 100850 )摘要通过对几种基质测定含不同碱基的寡核苷酸的灵敏度及精确度的比较 , 发现用混合基质 α-氰基 4-羟基肉桂酸 (α-Cyano) / 3-羟基吡啶羧酸 ( 3HPA)用于基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱中测定脱氧寡核苷酸 , 不仅能得到较好的分子离子峰 , 而且一些金属离子的加合物峰能得到有效的抑制 , 提高了测定的灵敏度。用 3′-和 5′-外切酶对脱氧寡核苷酸 12-mer ( 5′- ATG CAT ATG CAT -3′) 进行部分降解 , 再进行 MALDI - TOF - M S 分析 , 得到了完整的寡核苷酸的序列。关键词脱氧寡核苷酸 ; M ALDI - TOF - M S ; 外切酶; 序列分析收稿日期: 1996- 12- 03;接受日期: 1997- 01- 15。

* 联系人本文简称: M ALDI-TOF-M S, 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱。随着分子生物学和生物技术的迅猛发展 , 以及核酸在生命科学研究中的重要地位 ,有关核酸的分子生物学研究已经成为当前生命化学、分子生物学及医学领域最具有活力的研究方向之一。近年来 , 一些化学合成的或化学修饰的寡核苷酸在基因治疗以及基因诊断方面显示出良好的应用前景 , 因此 , 建立和发展一种更有效、灵敏、快速和精确的寡核苷酸的结构和序列分析方法一直是生物化学家们研究的课题之一。基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱 ( M ALDI-TOF-MS)技术的出现为生物大分子如蛋白质、核酸、多糖以及磷脂等的质量分析提供了新的途径[ 1～ 5] 。目前此项质谱技术已经广泛地应用在多肽及蛋白质的质量分析上[3, 4] 。在对化学合成及化学修饰的寡核苷酸的结构和序列分析上也显示出了一定的应用前景 , 已经出现了关于寡核苷酸及核酸片断的序列分析的报道[5～ 7] 。但到目前为止 , 对核酸的分析还远未达到与蛋白质同样的分析水平和广泛应用的程度 , 其原因主要有以下三个方面[8] :( 1) 因核酸分子中 N-戊糖键的碱基易断裂 , 使分子离子峰不稳定; ( 2) 痕量碱金属离子或基质导致加合物的生成; ( 3) 灵敏度低。

目前用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仅能分析分子量在 29 000以下的核酸片断和寡核苷酸 , 且尚未建立较为成熟的分析方法。本文通过对各种基质进行筛选 , 选择用混合基质对不同碱基的脱氧寡核苷酸 d( T) 10 、 d( A) 10 、d( C) 10 进行质量分析和对脱氧寡核苷酸12-mer ( 5′-ATG CAT ATG CAT-3′) 进行序列分析 , 取得了较好的结果。材 料 和 方 法1. 1材料1. 1. 1仪器英国 VG公司 TOFSpec基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪 , 配有 N 2 激光光源 , λ= 337 nm; 离子线性飞行距离为 65 cm。1. 1. 2试剂α-氰基 4-羟基肉桂酸 (α-Cyano) 和 3-羟基吡啶羧酸 ( 3HPA) 购自美国Aldrich公司。蛇毒磷酸二酯酶 ( SVP, EC 3. 1. 4. 1) 和牛脾磷酸二酯酶 ( CSP, EC 3. 1.16. 1) 购自 Sigma公司。1. 1. 3脱氧寡核苷酸d( pT) 10 标准品购自 Sigma公司。

实验装置如图 2-4所示： 13 水水氮气12345671、铁架台2、回流冷凝管3、分水器4、温度计5、油浴锅7、磁力搅拌器 图 2-4 9,9-双（3,5-二甲基-4-硝基苯氧基苯基）芴的合成实验反应装置图 2.2.3.3 9,9-双（3,5-二甲基-4-氨基苯氧基苯基）芴的合成 （1）催化剂的制备 制备步骤如下：取 6 g fecl 3 .6h 2 o 于 1000 ml 的单口瓶中，加入 750 ml 的去离子水，然后搅拌 2 h，完全溶解，然后取 4 g 氢氧化钠，完全溶于 50 ml 的蒸馏水中，得 2 mol/l 的氢氧化钠溶液。1.3.3样品溶液的制备:取溶液①作为测定zn、mn、cu的待测溶液。下列分析不正确的是a. a点表示ca(oh)2与cawo4均未达到溶解平衡状态b. 饱和ca(oh)2溶液和饱和cawo4溶液等体积混合: c(oh-)>c(h+)>c(ca2+)>c(wo42-)c. 饱和ca(oh)2溶液中加入少量na2o，溶液变浑浊d. 石灰乳与0.1mol/lna2wo4溶液混合后发生反应:ca(oh)2+wo42-=cawo4。

待溶液挥发后进行测定。( 2) 5′-3′降解取 15μL 12-mer脱氧寡核苷酸水溶液 ( 0. 3 g /L) 恒温至 37°C, 加入 1μL牛脾磷酸二酯酶( CSP) , 分别在 30, 50分钟各取 1. 5μL溶液 , 与 1. 5μL混合基质溶液充分混合后 , 取 1. 5μL点在靶上 , 待溶液挥发后进行测定。核苷酸序列分析结 果 和 讨 论2. 1基质的选择用 M ALDI-TOF-MS分析寡核苷酸样品最大的困难就是基质的选择 , 目前国外已经报道的用于分析核苷酸的基质较多 , 其中应用较多的主要有: 2, 4, 6, -三羟基苯乙酮、3-羟基吡啶羧酸 ( 3HPA)、 阿魏酸 ( FA)、 2, 5-二羟基苯甲酸 ( DHB) 等。这些基质在使用前必须经过脱盐处理 , 并且这些基质释放出的寡核苷酸的分子离子信号较难捕获到 ,不同的碱基灵敏度差别较大 , 顺序一般为 T> C> A> G[9] 。我们曾使用未进行脱盐处理的基质进行实验 , 得到的质谱图很差 , 在灵敏度和精确度上均达不到分析要求。α-氰基4-羟基肉桂酸 (α-Cyano) 基质一般主要用于分析多肽及蛋白质样品 , 实验中发现将其用于分析寡核苷酸样品同样能得到分子离子峰。

只是得到的峰由于碱金属离子 ( Na+, K+)的加合而变得较宽 , 精确度降低。α-Cyano基质的优点在于释放出的分子离子信号容易476生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 29卷捕获 , 灵敏度较高。将其与 3-羟基吡啶羧酸 ( 3HPA) 按一定比例混合后测定含有不同碱基的寡核苷酸样品 , 发现能得到较好的质谱图。特别是对较难捕获到分子离子信号的碱基 d( A) 10 和 d( C) 10 , 其灵敏度能达到同 d( T) 10 同样的水平 (图 1) , 使得基质的应用更具有普遍性。实验中还发现两种基质的混合比例对分析样品的灵敏度和丰度影响较大 , 比例太高或者太低都会大大降低其灵敏度。实验结果表明: 二者的最佳比例为 α-Cyano /3HPA (饱和溶液 ) = 3 1～ 2 1 (V /V)之间 , 在此条件下 , 寡核苷酸分子与碱金属离子的加合物峰被有效的抑制 , 得到的分子离子峰的精确度达到了分析的要求 (表 1) , 同时样品中一些合成或放置过程中出现的杂质也可测定出来 , 如在 d( A) 10 的质谱图中除有分子离子峰外 , 还发现了一些碎片峰 (图 1B)。

通过空白实验 , 发现混合基质本身的分子离子峰及其加合物峰均小于 600, 基本上不干扰对寡核苷酸及其片断的质量分析 , 并且混合基质可以不用脱盐处理而直接用于样品分析 , 其灵敏度和精确度都比较好 , 大大节省了操作时间 , 从而为 MALDI-TOF-M S在寡核苷酸的结构和序列测定奠定了较好的基础。Fig. 1 Negative ion M ALDI mass spectra of oligodeoxynucleotidesd ( T ) 10 、 d ( A ) 10 and d ( C ) 10Matrix : α - Cyano /3 HPA (5 2 V / V ).2. 2寡核苷酸序列测定经典的寡核苷酸测序方法通常用 Maxam-Gilbert法[ 10] 和 Wandering-Spot法 [11] , 但这些方法比较麻烦 , 而且需用放射性同位素。在对寡核苷酸特别是化学修饰的寡核苷酸的序列测定中显然不是很有效的方法。基质辅助激光解吸附飞行时间质谱的出现为我们477第 5期M ALDI - TOF - M S 对寡核苷酸的序列分析Fig. 2 Negtive ion M ALDI-TOF mass spectra resulting from partial digestionsby SV P of the oligonucleotide 5′-d( ATGCAT ATGCAT)-3′after digestion time( A ) 0 min , ( B ) 5 min , ( C ) 10 min提供了寡核苷酸测序的新途径 , 它具有较高的灵敏度和精确度 , 有很好的应用前景。

海肾-海萤-萤火虫三荧光素酶（triple luciferase报告基因活性化学发光法定量检测试剂盒是血液卵磷脂胆固醇乙酰转移酶（lcat）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过非界面性的水溶性单体底物，在磷脂酶或乙酰转移酶的水解下，其释放的产物发生吸收峰值的变化，即采用比色法来测定血液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。核苷酸还参与某些生物活性物质的组成：如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（nad+），尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nadp+）和黄素腺嘌呤二核苷酸（fad）。(3)由核酸分子编码，所述核酸分子在严格杂交条件下与选自由包含在实施例1中的t1r核酸序列和其保守性修饰的变体组成的组的序列特异性杂交(杂交长度至少约为100个核苷酸，或者至少约500～1000个核苷酸)。

有关基质辅助激光解析附飞行时间质谱测定化学修饰的寡核苷酸的序列及其他核酸切割试剂的筛选工作正在进行之中。核苷酸序列分析Table 1 Negative ion M ALDI - TOF M S of the oligonucleotide 12- mer partial cleavagedby 3′- exonuclease ( SVP )Peak Mass Found Mass Calc . Δm Residue Mass Sequence1 3643. 4 3643. 4 0 ATGCA TATGCAT2 3339. 1 3339. 2 - 0. 1 304. 3ATGCA TATGCA3 3028. 9 3026. 0 + 2. 9 310. 2ATGCA TATGC4 2737. 7 2736. 8 + 0. 9 291. 2 ATGCA TATG5 2407. 5 2408. 6 - 1. 1 330. 2 ATGCA TAT6 2104. 0 2104. 4 - 0. 4 303. 5 ATGCA TA7 1790. 4 1790. 2 + 0. 2 313. 6 ATGCA T8 1486. 4 1486. 0 + 0. 4 304. 0 ATGCA9 1173. 0 1172. 8 + 0. 2 313. 4 ATGC10 883. 9 883. 6 + 0. 3 289. 1 ATGTable 2 Negative ion M ALDI-TOF M S of the oligonucleotide 12-mer partial cleavagedby 5′-exonuclease ( CSP)Peak Mass Found Mass Calc. Δm Residue Mass Sequence1 3644. 3 3643. 4 + 0. 9 ATGCA TATGCAT2 3329. 9 3330. 2 - 0. 3 314. 8 TGCAT ATGCAT3 3025. 1 3026. 0 - 0. 9 304. 4GCATA TGCAT参 考 文 献[ 1 ] Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10 000 dal-tons. Anal Chem, 1988, 60: 2299- 2301.[ 2 ] Hillenkamp F, Karas M, Beavis R C et al. Matrix -assisted laser desorption /ionization mass spectrometry ofbiopolymers. Anal Chem, 1991, 63: 1193A- 1203A.[ 3 ] Karas M, Bahr U, Giessmann U. M atrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Mass Spec-479第 5期M ALDI - TOF - M S 对寡核苷酸的序列分析trom Rev , 1991, 10:335- 357.[ 4 ] Fitzgerald M C, Smith L M. Mass spectrometry of nucleic acids: the promise of matrix-assisted laser desorp-tion ionization mass spectrometry . Annu Rev Biophys Biomol Struct , 1995, 24:117- 140.[ 5 ] Pieies U, Zurcher W, Schar M et al. Matrix-assisted laser desorptionionization time-of-flight mass spectrome-try : a powerful tool for the mass and sequence analysis of natural and modified olig onucleotides . Nucleic AcidsRes, 1993, 21: 3191- 96.[ 6 ] Schuette J M, Pieles U, Malekia S D et al. Sequence analysis of phosphorothioate oligonucleotide via matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal, 1995, 13: 1195- 1203.[ 7 ] Smirnov I P, Roskey M T, Juhasz P et al. Sequence oligonucleotides by exonuclease degestion and delayedex traction matrix-assisted desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Anal Biochem, 1996, 238:19- 25.[ 8 ] Kaufmann R. Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry: a novel analytical tool in molecu-lar biology and biotechnolog y . J Biotechnol , 1995, 41: 155- 75.[ 9 ] Nordhoff E, Karas M , Cramer R et al. Direct mass spectrometric sequencing of low-picomole amounts ofoligodeox ynucleotides with up 21 base by matrix - assisted laser desorption ionization mass spectrometry . JMass Spectrom, 1995, 30: 99- 112.[10] Max am A M, Gilbert W. Sequencing end-labeled DN A with base-specific chemical cleavages. Methods Enzy-mol , 1980, 65: 499- 560.[11] Tu C D, Jay E, Bahl C P. A reliable mapping method for sequence determination of oligodeox yribonucleotidesby mobility shift analysis . Anal Biochem , 1976, 74:73- 93.Sequencing Analysis of Oligodeoxynucleotide by Matrix-AssistedLaser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass SpectrometryYAN Qing-Jin, YANG Song-Cheng and CAI Yun( National Center of Biomedical Analysis , Beijing 100850, China )WANG Sheng-Qi and ZHU Bao-Zhen( Institute of Radiation Medicine , Beijing 100850, China )ABSTRACTA mixed matrix α-cyano 4-hydroxycinnamic acid (α-Cyano) /3-hydroxypicolinic acid( 3HPA) was found to be a good matrix for the analysis of oligodeoxynucleotides by ma-trix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry ( M ALDI-TOF-M S) . Using the mixed matrix, a similar sensitivity was obtained for the differentoligodeoxynucleotides: d( T) 10 , d( A) 10 and d( C) 10 . This methodology can be used incombination with the partial digestion of oligodeoxynucleotides by 5′- and 3′-exonucle-ases as a powerful tool for sequencing analysis of oligonucleotides.KEY WORDS: Oligodeoxynucleotides;M ALDI-TOF-MS;Exonuclease;Sequencing analysis480生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 29卷