一种木瓜蛋白酶溶液酶制备方法与流程

本发明涉及一种木瓜蛋白酶溶液酶制备方法。

背景技术：

酶作为一类重要的生物催化剂，具有催化效率高、专一性强、反应条件温和、无污染等特点，被广泛地应用于制药、环保、食品、酿造等领域。但游离蛋白酶存在保存期短、稳定性差、不能回收等缺点，在工业上的应用受到一定限制。20世纪70年代兴起的固定化酶技术，为这些问题的解决提供了有效的手段，从而使酶的固定化成为当前酶工程的热门课题之一。木瓜蛋白酶生产方法酶的固定化技术是指采用吸附交联法、偶联法将酶固定于特定载体上的技术手段。木瓜蛋白酶生产方法酶固定化以后，既能保持酶的催化活性，又能克服游离酶存在的一些不足。固定化酶技术

能提高酶分子结构的稳定性，延长酶的使用期与保管期，并能与反应物及产物分开，有效控制生产过程，简化生产工艺，更重要的是固定化酶能在生产中反复连续使用，大幅度提高酶的利用率。固定化酶的上述优点为其在各个领域中的广泛应用开辟了新途径。

技术实现要素：

本发明提出一种木瓜蛋白酶溶液酶制备方法。

一种木瓜蛋白酶溶液酶制备方法，其特征在于包括以下步骤：

12. 0.lmol/l磷酸缓冲液(ph7.0) 称取na2hpo4·12h2o 35.82g，溶于1000ml蒸馏水中，为a液：称取nah2po4·2h2o15.605g，溶于l000ml蒸馏水中，为b液。 b) 酶稀释液 精确称取 0. 528 l-半胱氨酸盐酸盐及 0. 224g 乙二胺四乙酸二钠， ， 用 90ml 0. 05mol/l 磷酸氢二钠溶液溶解， 然后用 0. 1mol/l的氢氧化钠溶液或 0. 1mol/l的盐酸溶液调至 ph=0. 6， 加水定容至 100ml。1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的ph7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。

（2）从木瓜蛋白酶溶液中取1mL酶液，用pH 7磷酸缓冲溶液定容至100mL，于30-50℃水浴中恒温2min，加入40℃恒温2min的2％酪蛋白溶液l mL，在40℃条件下反应10min后，再加入2mL三氯乙酸(TCA)终止反应。对照则先在沸水中灭酶10 min，立即加入TCA溶液2mL终止反应，再置于30-50℃水浴中加入2％酪蛋白溶液1mL反应10min，静置10min后过滤后即得固定化酶微球；

(3)取0.1g固定化酶微球，置于10mL小试管中，加入1.0mL激活剂和1.0mL酪蛋白溶液，反应5-15min，加入终止剂终止，保温10min后取出混合物过滤后即得。

优选地，所述步骤（2）中水浴温度为40℃。

优选地，所述步骤（3）反应时间为10min。

本发明所述方法制备的木瓜蛋白酶溶液酶，酶的活性强，制备工艺简单，实用性强，可工业化生产。

具体实施方式

实施例1。

一种木瓜蛋白酶溶液酶制备方法，其特征在于包括以下步骤：

12. 0.lmol/l磷酸缓冲液(ph7.0) 称取na2hpo4·12h2o 35.82g，溶于1000ml蒸馏水中，为a液：称取nah2po4·2h2o15.605g，溶于l000ml蒸馏水中，为b液。 b) 酶稀释液 精确称取 0. 528 l-半胱氨酸盐酸盐及 0. 224g 乙二胺四乙酸二钠， ， 用 90ml 0. 05mol/l 磷酸氢二钠溶液溶解， 然后用 0. 1mol/l的氢氧化钠溶液或 0. 1mol/l的盐酸溶液调至 ph=0. 6， 加水定容至 100ml。1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的ph7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。

（2）从木瓜蛋白酶溶液中取1mL酶液，用pH 7磷酸缓冲溶液定容至100mL，于30-50℃水浴中恒温2min，加入40℃恒温2min的2％酪蛋白溶液l mL，在40℃条件下反应10min后，再加入2mL三氯乙酸(TCA)终止反应。对照则先在沸水中灭酶10 min，立即加入TCA溶液2mL终止反应，再置于30-50℃水浴中加入2％酪蛋白溶液1mL反应10min，静置10min后过滤后即得固定化酶微球；

(3)取0.1g固定化酶微球，置于10mL小试管中，加入1.0mL激活剂和1.0mL酪蛋白溶液，反应5-15min，加入终止剂终止，保温10min后取出混合物过滤后即得。

实施例2。

一种木瓜蛋白酶溶液酶制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）称取0.5g木瓜蛋白酶，溶于0.02mol／L，在pH7的磷酸缓冲溶液，并定容至50mL，得10mg／mL木瓜蛋白酶溶液备用；

（2）从木瓜蛋白酶溶液中取1mL酶液，用pH 7磷酸缓冲溶液定容至100mL，于30-50℃水浴中恒温2min，加入40℃恒温2min的2％酪蛋白溶液l mL，在40℃条件下反应10min后，再加入2mL三氯乙酸(TCA)终止反应。对照则先在沸水中灭酶10 min，立即加入TCA溶液2mL终止反应，再置于30-50℃水浴中加入2％酪蛋白溶液1mL反应10min，静置10min后过滤后即得固定化酶微球；

(3)酶活的测定 取1ml0.5％球磨滤纸底物溶液于15ml刻度试管中，在39℃水浴中振荡30min，加入0.2ml处理好的酶液，并开始计时，继续振荡60min，立即加入dns溶液2ml终止反应，在沸水浴上加热10min使反应完全，迅速用冷水冷却，用水定容至15ml，用1cm比色皿，550nm波长处测定吸光度，从葡萄糖标准工作曲线上查出试样浓度，并计算酶活性。1. sio2的测定：准确称取试样0.5g左右，置于干燥的50ml烧杯中，加2g固体nh4cl，用玻璃棒混合，加2ml浓hcl和1滴hno3，充分搅拌均匀，使所有深灰色试样变为浅黄色糊状物，盖上表面皿，置于沸水浴上，加热10min，加10ml热的3%hcl溶液搅拌溶解可溶性盐，趁热用中速定量滤纸过滤，滤液用250ml容量瓶盛接，用热的3%hcl溶液洗涤烧杯5～6次后，继续用热的3%hcl溶液洗涤沉淀至无fe3+离子为止，冷却后，稀释至刻度，摇匀后保存，作为测定铝、铁、钙、镁等含量用。其方法如下 取1ml0.5％(ph＝6.0)的球磨滤纸底物溶液于15ml刻度试管中，在39℃水浴中振荡30min，加入0.2ml处理好的酶液，并开始计时，继续振荡60min，立即加入dns溶液2ml终止反应，在沸水浴上加热10min使反应完全，迅速用冷水冷却，用水定容至15ml，用1cm比色皿，550nm波长处测定吸光度，参照葡萄糖标准工作曲线上查出试样浓度，计算出纤维素酶活性。

优选地，所述步骤（2）中水浴温度为40℃。

实施例3。

一种木瓜蛋白酶溶液酶制备方法，其特征在于包括以下步骤：

12. 0.lmol/l磷酸缓冲液(ph7.0) 称取na2hpo4·12h2o 35.82g，溶于1000ml蒸馏水中，为a液：称取nah2po4·2h2o15.605g，溶于l000ml蒸馏水中，为b液。 b) 酶稀释液 精确称取 0. 528 l-半胱氨酸盐酸盐及 0. 224g 乙二胺四乙酸二钠， ， 用 90ml 0. 05mol/l 磷酸氢二钠溶液溶解， 然后用 0. 1mol/l的氢氧化钠溶液或 0. 1mol/l的盐酸溶液调至 ph=0. 6， 加水定容至 100ml。1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的ph7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。

(3)酶活的测定 取1ml0.5％球磨滤纸底物溶液于15ml刻度试管中，在39℃水浴中振荡30min，加入0.2ml处理好的酶液，并开始计时，继续振荡60min，立即加入dns溶液2ml终止反应，在沸水浴上加热10min使反应完全，迅速用冷水冷却，用水定容至15ml，用1cm比色皿，550nm波长处测定吸光度，从葡萄糖标准工作曲线上查出试样浓度，并计算酶活性。(1)量取250ml水样置蒸馏瓶中，加数粒小玻璃珠以防暴沸，再加二滴甲基橙指示液，用磷酸溶液调节至ph4（溶液呈橙红色），加5.0ml硫酸铜溶液(如采样时已加过硫酸铜，则补加适量)。２． 不同时期加入底物对乳酸菌Ｌ ｎ 菌酶降解亚硝酸盐的影响配制ｐ Ｈ 为６ ． ０ 的磷酸缓冲培养液， 均分成６ 份， 灭菌后按５％的接种量接种， 然后分别在０ 、 ４ 、 ８ 、 １８ 、 ３６ 、 ４ ８ 小时加入一定量已灭菌的亚硝酸盐母液， ３０ ＊ （ ２恒温培养。

(3)取0.1g固定化酶微球，置于10mL小试管中，加入1.0mL激活剂和1.0mL酪蛋白溶液，反应5-15min，加入终止剂终止，保温10min后取出混合物过滤后即得。

优选地，所述砂料是耐火砂时，所述混砂步骤中的混合搅拌时间为40 60秒。作为优选，所述的步骤b中升温的温度为70 95°c。 进一步优选地，所述的酸性电解质为选自盐酸、硝酸、硫酸、氢氟酸中的一种、或其中的两种或两种以上的混合物，更优选地，所述的酸性电解质为盐酸。