农杆菌质粒载体_农杆菌质粒构成_农杆菌转化质粒(2)

（3）试分析在C端加上KDEL的内质网滞留序列，为什么可以避免胰岛素在植物细胞中的降解？_________。

（4）用目的基因与农杆菌的Ti质粒结合构建表达载体，该表达载体的组成中不应含有的是_________（从下列选项中选择）。

①目的基因

②CaMV 35S启动子

③果实专一性启动子2A12

④RNA引物

⑤标记基因

⑥T-DNA

⑦RNA聚合酶基因片段

⑧终止子

（16分）Ⅰ.（8分）土壤农杆菌是一种能引起双子叶植物产生冠瘿瘤的土壤细菌，它带有一个大的质粒叫Ti质粒，它是携带细菌DNA向宿主植物基因组转化所需信息的重要片段，只有T—DNA片段才转入植物细胞的基因组。结构及转化过程如图所示，回答相关问题：

（1）为了使某种植物具有抗旱性状而又不引起植物产生冠瘿瘤，需对Ti质粒进行修饰，即祛除瘤基因，将抗旱基因转移至________，然后在一定条件下将外植体在含土壤农杆菌的稀释培养基上培养，此时修饰的T—DNA转入植物细胞并整合到植物基因组中。以上过程需要的工具有。

（2）将上述外植体置于一个含有某种抗生素的合适培养基中进行筛选，发生转化的外植体开始增殖，形成________ ，通过产生不定芽再长出整个植物。

（3）基因转化是否成功应对转基因植物进行鉴定，可以直接在________水平对转基因植物与非转基因植物进行比较。

Ⅱ．（8分）请回答基因工程方面的有关问题：

(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图所示）。

（1）图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。农杆菌质粒载体

①从理论上推测，第四轮循环产物中不含有引物B的DNA片段所占的比例为。

②在第轮循环产物中首次出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

（2）PCR反应体系中含有的DNA聚合酶具有特点，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为。

（16分）下面是在农杆菌Ti质粒基础上构建的植物抗虫基因表达载体的示意图。请据图回答：

（1）为了扩大基因表达载体的数量，需将基因表达载体再植入农杆菌中并对农杆菌进行培养，此时，在培养农杆菌的培养基中应加入，该培养基按用途划分属于。

（2）带有抗虫基因的农杆菌进入棉花细胞后，要检测抗虫基因是否插入到棉花的染色体DNA上，常用的方法是；要检测抗虫基因在棉花体内是否翻译成蛋白质，必需先从转基因棉花中提取蛋白质，再用相应的方法来确定是否已形成毒蛋白；如果在个体水平上鉴定抗虫基因是否转化成功，可以通过实验来实现。

（3）Ti质粒的分子大小有200kb（千碱基对）左右，然而能进入植物细胞的只有一小部分约25kb（称为T—DNA）。农杆菌质粒载体在这一小部分的两端各有一个25bp（碱基对）长的重复序列LB和RB，这两个序列对这一小部分DNA进入植物细胞是不可缺少的。实验证明只要Ti质粒上保留了这两个序列，即使这两个序列之间的其它序列被不同程度地改变（如插入一个外源DNA片段），这一小部分也仍然可以转移并整合到植物的基因组中。

① 在构建的T—DNA过程中，还应该具有和等结构，才能保证进入植物体的抗虫基因能够顺利表达。

②Ti质粒不同于其它质粒的最大特点就是它含有T—DNA，如果给你一个不含T—DNA的质粒，你如何把它构建成含有T—DNA的质粒？ 。